Optimization of Crosslinked Peptide Analysis on an Orbitrap Fusion Lumos Mass Spectrometer

Význam tématu

Chemická křížkování bílkovin ve spojení s hmotnostní spektrometrií představuje klíčovou metodu pro mapování kontaktů ve strukturách proteinu a interakcí mezi proteiny v komplexních vzorcích. Vzhledem k rostoucímu zájmu o studium proteinových komplexů in vivo a charakterizaci funkčních interakcí na proteomické úrovni umožňuje tato technika identifikovat kovalentně propojené peptidy a odhalit místa kontaktu, což je zásadní pro vývoj léků, strukturální biochemii a systémy proteomiky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkon tradičních neštěpitelných a MS-štěpitelných křížkovacích činidel BS3 DSS DSSO BuUrBu a různých režimů MS fragmentace CID HCD ETD EThcD včetně úrovní MS2 a MS3 pro optimalizaci identifikace křížkovaných peptidů. Studie hodnotila účinnost křížkování na vzorcích BSA a celkovém lyzátu E coli přičemž byla použita software XlinkX v rámci Proteome Discoverer pro vyhledávání křížkovaných peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorci BSA byli křížkováni v pufru HEPES pH 8 při různých molárních násobcích činidla 20× 100× 500× a následně se vzorky redukovaly alkylovaly a trávily trypsinem. Celkové lyzáty E coli byly křížkovány 20× frakcovány na kolonce Retain CX podle koncentrace amoniakální soli a desalinizovány C18 před LC MS analýzou. K fragmentaci byly porovnány režimy MS2 CID HCD ETD EThcD a MS3 v kombinaci s lineárně peptidovým či standardním vyhledávacím módem v XlinkX.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer
• Q Exactive HF mass spectrometer
• Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RP HPLC se sloupcem EASY Spray 50 cm × 75 μm
• Thermo Scientific HyperSep Retain CX kolonka pro frakcionaci peptidů

Hlavní výsledky a diskuse

• Neštěpitelná činidla BS3 a DSS vykázala vyšší účinnost křížkování BSA než MS-štěpitelná DSSO a BuUrBu pravděpodobně vlivem délky a rozpustnosti reagencií.
• U MS-štěpitelných činidel DSSO a BuUrBu vedlo použití MS2-MS3 přístupu s lineárně peptidovým režimem vyhledávání k identifikaci více než 40 inter křížkovaných peptidů BSA zatímco konvenční MS2 CID poskytl méně než 20.
• Optimalizace EThcD energie 20 25 30 ovlivnila intenzitu fragmentů a výtěžek unikatních křížkovaných peptidů přičemž střední energie 25 často poskytla nejlepší kompromis.
• Na komplexním vzorku celého lyzátu E coli kombinace MS2-MS3 se sekundární EThcD fragmentací dosáhla nejvyššího počtu identifikovaných křížkovaných peptidů oproti ostatním režimům.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace MS-štěpitelných crosslinkerů v kombinaci s pokročilou fragmentací MS3 a EThcD výrazně zlepšuje pokrytí mapy interakcí i v komplexních biologických vzorcích. Tento přístup umožňuje detailní zobrazení kontaktů v proteinových komplexech a rozšiřuje možnosti kvantitativní proteomické analýzy interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj reagencií s vylepšenou směrodatností fragmentace a vyšší rozpustností pro rozšíření aplikace in vivo.
• Integrace MSn metod a pokročilých algoritmů strojového učení pro rychlejší a přesnější vyhledávání křížkovaných peptidů.
• Automatizace workflow a zpracování velkých datasetů pro vysokoprovozní mapování interakcí ve více vzorcích.
• Široké uplatnění v strukturální biologii vývoji proteinových léčiv a inženýringu enzymů.

Závěr

Studie ukazuje že optimalizované použití MS-štěpitelných crosslinkerů DSSO a BuUrBu spolu s MS2 MS3 a EThcD fragmentací přináší významný nárůst identifikací křížkovaných peptidů a to nejen na jednoduchých standardech jako BSA ale i v komplexních buněčných lyzátech. Tento přístup nabízí spolehlivou platformu pro detailní mapování protein protein interakcí.

Reference

• Kao A et al Development of a novel crosslinking strategy for fast and accurate identification of crosslinked peptides of protein complexes Mol Cell Proteomics 2011 10(1):M110002212
• Müller MQ et al Cleavable crosslinker for protein structure analysis reliable identification of crosslinking products by tandem MS Anal Chem 2010 82(16):6958–68
• Liu F et al Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross linking mass spectrometry Nat Methods 2015 12(12):1179–84