Identification and quantitation of oligonucleotides, impurities, and degradation products

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů a jejich nečistot je klíčová pro vývoj moderních terapeutických látek a zajištění kvality v biotechnologickém průmyslu. Detailní charakterizace vedlejších produktů a degradačních látek podporuje bezpečnost, účinnost a stabilitu oligonukleotidových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout citlivou a robustní metodu datově závislé tandemové hmotnostní spektrometrie (ddMS2) s vysokým rozlišením (HRAM) pro identifikaci, mapování a relativní kvantifikaci nečistot v terapeutických oligonukleotidových vzorcích v jediné analýze. Metoda byla demonstrována ve třech případech:

• porovnání účinnosti čištění syntetického DNA 21mer získaného standardním odsolením vs. HPLC,
• charakterizace degradačních produktů vzniklých tepelným a oxidačním stresem,
• strukturální objasnění vysokomolekulárních (MW) nečistot.

Metodika

Oligonukleotidy byly separovány iontově párovou reverzní fází (HFIP/DIPEA) na UHPLC systému při 60 °C a flow 0,4 mL/min. K detekci sloužil Orbitrap Exploris 240 v negativním režimu s rozlišením 120 000 pro MS1 a 30 000 pro ddMS2. Pro fragmentaci byla optimalizována stupňovaná kolizní energie (stepped NCE 18-20-22), která poskytla úplné pokrytí sekvence (ASR ≈ 1). Tření degradace vyvolané zahřátím (80 °C) a oxidačním stresem (5 % H2O2) proběhlo v časech 1–24 h.

Použitá instrumentace

• UHPLC Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC system
• Kolona Thermo Scientific DNAPac RP (4 µm, 2.1 × 50 mm)
• Mass spektrometr Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240
• Software Thermo Scientific BioPharma Finder 4.0 (Oligonucleotide Analysis)

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace stepped NCE 18-20-22 zajistila kompletní mapování fragmentů 21mer a nízkomolekulárních nečistot.
• Porovnání čištění: HPLC vzorek vykázal pokles celkových n-x nečistot z 2,55 % na 1,18 %, včetně důkazu velmi nízké úrovně n-16 (~0,015 %) potvrzené ddMS2.
• Tepelný stres způsobil rychlý úbytek plného produktu po 2–4 h a nárůst n-x, base loss a depurinace/depyrimidinace produktů s postupem času.
• Oxidační stres neovlivnil významně celkovou míru degradu, avšak zvýšil podíl oxidovaných sekvencí.
• Vysokomolekulární nečistoty (M + n-x) byly detekovány pouze v odsoleném vzorku, dekonvoluce potvrdila souhlas hmotností s chybou < 1 ppm. ddMS2 mapování odhalilo větvenou strukturu spojující 5′ konec kratšího fragmentu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda HRAM ddMS2 umožňuje komplexní profilování oligonukleotidových vzorků v jediné analýze, včetně identifikace velmi nízkých úrovní nečistot, lokalizace modifikací a relativní kvantifikace. Podporuje optimalizaci purifikačních postupů, sledování stability a zajištění kvality terapeutických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření workflow o automatizované zpracování dat, aplikace na delší a chemicky modifikované oligonukleotidy, integrace datově nezávislých akvizic (DIA) a prohloubené strukturní analýzy komplikovaných nečistot.

Závěr

Prokázaná ddMS2 metoda s HRAM hmotnostní spektrometrií a softwarem BioPharma Finder nabízí robustní a citlivý přístup k identifikaci, mapování a relativní kvantifikaci nečistot a degradačních produktů oligonukleotidů, což významně přispívá ke kvalitativní kontrole a vývoji terapeutických látek.

Reference

• Wang F et al. RNA therapeutics on the rise. Nat Rev Drug Discov. 2020;19:441.
• Bajan S et al. RNA-based therapeutics: from antisense oligonucleotide to miRNAs. Cells. 2020;9:137.
• Rossi JJ et al. Oligonucleotides and the COVID-19 pandemic: a perspective. Nucleic Acid Ther. 2020;30:129.
• Sutton JM et al. Current state of oligonucleotide characterization using LC-MS. J Am Soc Mass Spectrom. 2020;31:1775.
• El Zahar NM et al. Chromatographic approaches for oligonucleotide impurities. Biomed Chromatogr. 2018;32:e4088.
• Pourshahian S. Therapeutic Oligonucleotides: characterization by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 2019.
• Capaldi D et al. Impurities in oligonucleotide drug substances and products. Nucleic Acid Ther. 2017;27:309.
• Liu HC et al. Oligonucleotide mapping using BioPharma Finder software. Thermo Fisher App Note. 2020.
• Kurata C et al. High molecular weight impurities in phosphorothioate oligonucleotides. Bioorg Med Chem Lett. 2006;16:607.