Oligonucleotide mapping using BioPharma Finder software

Význam tématu

Ion-párovaná RP LC ve spojení s vysokým rozlišením Orbitrap MS a ddMS2 poskytuje detailní mapování sekvence oligonukleotidů, což je klíčové pro vývoj a kontrolu terapeutických ASO a siRNA.
Rychlé a spolehlivé stanovení sekvence, lokalizace modifikací i kvalita dat výrazně ovlivňují analýzu stability, čistoty a identity bioléčivých molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a optimalizovat metodu LC-ddMS2 na Orbitrapu pro netargetovanou analýzu oligonukleotidů. Studium zahrnovalo vývoj workflow v BioPharma Finder 4.0, které umožňuje automatickou identifikaci, anotaci a mapování posloupnosti bez nutnosti předdefinovaných hmotových seznamů.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon s kolónou DNAPac RP (2,1×50 mm, 4 µm)
• MS: Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap v negativním módu
• Solventy: voda, MeOH; roztok A obsahuje 190 mM HFIP a 5,7 mM DIPEA, roztok B 7,1 mM HFIP a 2,1 mM DIPEA v MeOH
• Software: BioPharma Finder 4.0 s Oligonucleotide Analysis workflow
• Metoda: gradient 20–80 % B během 6,5 min, MS1 rozlišení 70 000, ddMS2 top5 rozlišení 35 000, S-lens RF 60, izolace m/z 2,0

Hlavní výsledky a diskuse

• Baseline separace oligonukleotidů o délce 15–45 nt s vysokou reprodukovatelností
• Optimalizace S-lens RF: nejvyšší signál pro klíčové nábojové stavy při RF 60–65
• Optimalizace HCD NCE: stepped NCE 15-17-19 pro 20mer přineslo kompletní fragmentní pokrytí (ASR 1,0); obdobné optimum pro 25merMod, RNA20mer a 45mer
• ASR (average structural resolution) jako kvantitativní metrika úplnosti fragmentace pro výběr nejvhodnějších (N)CE
• Multi-konsenzusní analýza dat umožnila rychlé porovnání podmínek i pro směsi oligonukleotidů
• Diferenciace izomerů (20merAC vs. 20merCA) na základě diagnostických fragmentů, např. iont w7³⁻

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá optimalizace metod pro sekvenční mapování oligonukleotidů bez cílových hmotových seznamů
Automatizované anotace a reporty usnadňují rutinní QC, validaci a stabilitní studie bioléčiv
Porovnávání více běhů zjednodušuje vývoj metod a potvrzení reproducibility

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na větší, modifikované a konjugované oligonukleotidy
• Analýza vzorků v komplexních biologických matricích (plazma, tkáně)
• Kvantitativní HRAM ddMS2 pro pharmacokinetické a stability studie
• Integrace do GMP/QC prostředí s plnou automatizací výsledků
• Současné multi-omické přístupy kombinující proteomiku a metabolomiku

Závěr

Navržená HRAM LC-ddMS2 metoda spolu s BioPharma Finder 4.0 představuje robustní platformu pro detailní sekvenční mapování oligonukleotidů a usnadňuje jejich vývoj, validaci i rutinní kontrolu kvality.

Reference

1. Wang F. et al. RNA therapeutics on the rise. Nat Rev Drug Discov 2020;19:441.
2. Bajan S. et al. RNA-based therapeutics: from antisense oligonucleotide to miRNAs. Cells 2020;9:137.
3. Yin W. et al. Targeting RNA: a transformative therapeutics strategy. Clin Transl Sci 2019;12:98.
4. Rossi JJ. et al. Oligonucleotides and the COVID-19 pandemic: a perspective. Nucleic Acid Ther 2020;30:129.
5. Pourshahian S. et al. Therapeutic oligonucleotides, impurities, degradants, and their characterization by MS. Mass Spectrom Rev 2019.
6. Schurch S. et al. Characterization of nucleic acids by tandem MS: the second decade. Mass Spectrom Rev 2016;35:483.