Efficient early-phase screening of siRNA purity and impurities via denaturing IP-RPLC-UV with a dual-channel UHPLC system

Význam tématu

Analýza siRNA je klíčová pro vývoj terapeutických oligonukleotidů, protože tyto molekuly mají větší strukturální složitost (duplexová architektura, chemické modifikace, konjugace) než běžné malé molekuly. Rychlé a robustní metody pro časnou fázi výběru kandidátů umožňují efektivní posouzení čistoty a profilů nečistot, zkracují dobu vývoje a snižují náklady. Ion-pairing reverzní fáze (IP-RP) za denaturačních podmínek je často prvním krokem metodického skautingu díky vysokému rozlišení, kompatibilitě s hmotnostní spektrometrií a schopnosti rozdělit duplexy na jednotlivé řetězce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo provést rychlý, souhrnný a systematický IP-RP screening tří GalNAc-konjugovaných siRNA kandidátů kombinací šesti iontových párovacích (IP) činidel a čtyř stacionárních fází pomocí duálního UHPLC systému Vanquish Duo. Hlavním záměrem bylo zkrátit dobu experimentu pro early‑phase metodický vývoj, minimalizovat manuální zásahy a získat komplexní dataset pro výběr optimálních podmínek separace.

Použitá metodika

• Vzorky: tři GalNAc-konjugované siRNA, připravené jako duplexy (1 mg/mL) a izolované sense/antisense řetězce (0,5 mg/mL).
• Scouting matice: 6 IP činidel se vzrůstající hydrofobicitou – DEA, TEA, DIPEA, DBA, TPA, HA (25 mM) vždy v kombinaci s 100 mM HFIP; 4 typy kolonek – bioinertní C8, plně porózní C18, fenyl a core‑shell C18 (vše 1.7 µm, 2.1 x 50 mm).
• Gradient: široký screeningový gradient 10 % → 90 % B během 30 min po 1 min izokratické fázi; mobilní fáze A/B tvořeny směsí H2O/MeOH nebo MeOH/H2O s IP/HFIP podle tabulky.
• Provozní podmínky: tok 0,3 mL/min; teplota kolony 75 °C (denaturační režim); injekční objem 2 µL; detekce UV 260 nm, 20 Hz.
• Hodnocení: primárním metrikem byla retenční časová diference (ΔRT) mezi AS a SS řetězci; nastavená prahová hodnota pro užitečnou separaci ΔRT ≥ 0,5 min. Sledují se i procentuální plochy píku jako nepřímý indikátor rozlišení nečistot.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Duo UHPLC System (System Base Vanquish Duo).
• 2× Vanquish Binary Pump H, 2× Vanquish Column Compartment H, 2× Vanquish Diode Array Detector HL (biokompatibilní LightPipe flow cell 2 µL), Vanquish Dual Split Sampler HT.
• Chromeleon Chromatography Data System 7.2.10 pro řízení obou flow pathů a zpracování dat (GxP kompatibilita, správa sekvencí, reporting).
• Reagencie: 25 mM alkylaminy (DEA, TEA, DIPEA, DBA, TPA, HA), 100 mM HFIP, LC methanol, ultra‑čistá voda.

Hlavní výsledky a diskuse

• Provedeno 320 chromatografických běhů během 48 hodin — systém Vanquish Duo umožnil zkrácení instrumentálního času přibližně o 50 % oproti konvenčnímu single‑LC řešení díky paralelnímu provozu dvou nezávislých flow path a snížení manuálních zásahů.
• IP činidla vykazovala sekvenčně závislé výkony: DIPEA byl optimální pro separaci SS/AS u siRNA 1 a 3 napříč fázemi; DBA a HA lépe rozlišovaly komponenty u siRNA 2. To indikuje, že retence závisí na specifických strukturálních a konformačních vlastnostech řetězců (nukleotidové složení, expozice fosfátových skupin, přítomnost GalNAc).
• Fenylová fáze v kombinaci s TEA zajistila efektivní separaci pro všechny tři kandidáty, i když s rozdílnou kvalitou tvaru píků mezi vzorky.
• U silně hydrofobních IP činidel (zejména HA) byla pozorována baseline nestabilita, což může omezovat jejich použití — literatura uvádí možnou souvislost s reziduálními nečistotami v těchto činidlech.
• Byla zaznamenána inverze pořadí eluace AS/SS u některých kombinací (DBA, HA) pro siRNA 1 a 2, což naznačuje, že konformace a lokalizace konjugátů (GalNAc) mění přístupnost iontového páru a interakce se stacionární fází.
• Mezi plně porózním a core‑shell C18 nebyl zaznamenán zásadní rozdíl ve výkonu za těchto podmínek; celkově dominují interakce analyte–IP‑reagent nad specifickou chemií kolonové fáze.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená efektivita: paralelní scouting zkracuje dobu metodického vývoje a umožňuje rychlejší rozhodování v early‑phase screeningu.
• Snížení nákladů a práce: méně manuálních zásahů, méně přepojování kolonek a mobilních fází, optimalizované využití instrumentu a spotřebního materiálu.
• Komplexní datová základna: jediné experimentální uspořádání poskytuje široké spektrum podmínek, zajišťuje informativní porovnání a minimalizuje potřebu opakovaných experimentů.
• Praktické doporučení: zahájit scouting s rodinou alkylaminů různé hydrofobicity a porovnat několik typů kolon; sledovat ΔRT mezi řetězci a tvar píků; být obezřetný u velmi hydrofobních IP činidel kvůli baseline problémům.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace LC‑MS: použití volatilních IP systémů (HFIP + nízkomolekulové aminy) a optimalizace pro přímé hyphenované MS analýzy pro identifikaci a kvantifikaci nečistot.
• Automatizace a vyšší paralelizace: rozšíření duálních a multi‑LC konfigurací pro širší screening a vyšší propustnost v preklinické fázi.
• Vývoj nových IP činidel: cílené návrhy méně kontaminujících, stabilních a MS‑kompatibilních alkylaminů pro zlepšení baseline stability a citlivosti.
• Pokročilá datová analytika: použití strojového učení pro prognózu optimálních kombinací IP‑reagent/kolona na základě sekvenčních vlastností siRNA, čímž se zkrátí počet experimentálních iterací.
• Rozšíření na orthogonální techniky: kombinace IP‑RP s AEX nebo HILIC v rámci multi‑dimenzionálních workflow pro komplexní profilaci nečistot.

Závěr

Systematický IP‑RP scouting provedený na duálním Vanquish Duo UHPLC systému demonstroval efektivní přístup k časnému výběru analytických podmínek pro GalNAc‑konjugované siRNA. Výsledky ukazují, že volba iontového páru má zásadní vliv na rozlišení řetězců a že chování je často závislé na sekvenci a konformaci analyzátu. Duální paralelní konfigurace významně urychluje získávání dat, snižuje manuální zásahy a poskytuje šíroký přehled, který podporuje informovaná rozhodnutí v early‑phase vývoji siRNA terapeutik.

Reference

1. Guo S. et al., Three ‘E’ challenges for siRNA drug development, Trends Mol Med, 2024, 30(1), 13–24.
2. Hu B. et al., Therapeutic siRNA: state of the art, Signal Transduct Target Ther, 2020, 5(1), 101.
3. Goyon A. et al., Characterization of therapeutic oligonucleotides by liquid chromatography, J Pharm Biomed Anal, 2020, 182, 113105.
4. Fornstedt T. et al., Separation of therapeutic oligonucleotides using ion-pair reversed-phase chromatography based on fundamental separation science, J Chromatogr Open, 2023, 3, 100079.
5. Thermo Scientific Application Note 000471: Simultaneous reversed-phase and anion-exchange method scouting with a dual system for mRNA impurity determination, 2022.
6. Thermo Scientific Technical Note 185: A UHPLC Method Development System for Efficient Scouting of Chromatographic Elution Parameters, 2016.
7. Thermo Scientific Application Note 004305: Enhanced analytical flexibility: simultaneous normal and reversed phase chromatography, 2026.
8. Thermo Scientific Application Note 72601: Doubling the throughput of long chromatographic methods by using a novel Dual LC workflow, 2018.
9. Donegan M. et al., Effect of ion-pairing reagent hydrophobicity on liquid chromatography and mass spectrometry analysis of oligonucleotides, J Chromatogr A, 2022, 1666, 462860.