Analyzing Raw Material for Oligonucleotide Synthesis

Význam tématu

Analýza surovin v syntéze oligonukleotidů, konkrétně nucleosidových fosforamiditů, je nezbytná pro zajištění vysoké kvality výsledných bioléčiv a minimalizaci sekvenčních chyb při DNA syntéze.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace je vyvinout flexibilní a robustní kapalinové chromatografické (LC) metody pro stanovení 5'-DMT-deoxyadenosinu 3'-fosforamiditu a jeho nečistot pomocí Agilent 1290 Infinity II Bio LC a pokročilé hmotnostní spektrometrie.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu bylo použito Agilent 1290 Infinity II Bio LC System se čtyřkanálovým flexibilním čerpadlem, multisamplerem s termostatem, multikolónovým termostatem a VWD detektorem, spojeným s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro přesné stanovení hmotnosti. Použity byly dvě chromatografické metody:

• Metoda A: terciární gradient s 500 mM acetátem amonným (pH 5,5) na C18 kolóně (2,1 × 100 mm) při 0,2 mL/min, doba běhu 25 min.
• Metoda B: optimalizovaná krátká metoda s proudem 0,6 mL/min a stejným gradientem k redukci doby analýzy na 8,33 min.

Hlavní výsledky a diskuse

Obě metody umožnily identifikaci hlavního produktu a několika nečistot, včetně epimerů fosforu a tzv. reverse amidite. U metody A byly dosaženy výborné hodnoty RSD retence 0,015–0,050 % a RSD ploch 0,113–0,539 %. Přenos metody mezi Bio LC a konvenčním LC vykázal rozdíly retenčních časů pod 1 %. Metoda B zkrátila analýzu o 66 % při zachování přesnosti a rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinuté postupy nabízejí:

• Robustní kontrolu kvality surovin pro oligonukleotidovou syntézu.
• Rychlé přizpůsobení gradientů díky flexibilnímu čerpadlu.
• Šetření času a zvýšení produktivity QA/QC laboratoří.
• Bezproblémový přenos metod napříč odděleními.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky o automatizaci přípravy vzorků, využití umělé inteligence pro optimalizaci gradientů, rozšíření na další typy oligonukleotidů a integrace s vysokopropustnými platformami pro genomickou analytiku.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II Bio LC System ve spojení s LC/Q-TOF poskytuje rychlou, přesnou a snadno přenositelnou metodu pro analýzu nucleosidových fosforamiditů, čímž zvyšuje spolehlivost a efektivitu procesů syntézy oligonukleotidů.

Reference

• Hughes R.A., Ellington A.D. Synthetic DNA Synthesis and Assembly: Putting the Synthetic in Synthetic Biology. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2017, 9, a023812.
• Roberts T.C., Langer R., Wood M.J.A. Advances in Oligonucleotide Drug Delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 2020, 19, 673–694.
• Beaucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside Phosphoramidites—A New Class of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis. Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859–1862.