A Workflow for Rapid Sample Preparation and Exoglycosidase Characterization of N-Glycans in Antibodies

Význam tématu

Proteinová glykosylace zásadně ovlivňuje vlastnosti bioterapeutických glykoproteinů, včetně stability, rozpustnosti, imunitních interakcí a farmakokinetiky. Přesné charakterizování N-glykanů je klíčové pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik a pro monitoring kritických kvalitativních atributů (CQA) během vývoje a výroby.

Cíle a přehled studie

Studie představuje nově vyvinutý 96-jamkový workflow pro rychlou přípravu vzorků a fluorescentní derivatizaci N-glykanů z lidské imunoglobuliny G (IgG) pomocí sady Agilent AdvanceBio Gly-X N-glycan prep s InstantPC. Následuje on-matrix čištění a analýza pomocí HILIC/FLD a validace struktur sekvenční exoglykozidázovou digescí.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow je členěno do tří modulů:

• Deglycosylace (GX96-100): denaturace 90 °C/3 min + enzymatická deglycosylace 50 °C/5 min
• InstantPC označení (GX96-101): rychlé 1min reakce při 50 °C s aktivovaným NHS-karbamátem
• Čištění (GX96-102): on-matrix odstranění nevyužitého barviva a solí

Použité enzymy pro exoglykozidázovou validaci:

• Sialidáza A (α(2-3,6,8,9) NANA)
• β(1-4)-Galaktosidáza (β galaktóza)
• β-N-Acetylhexosaminidáza (β GlcNAc)

Instrumentace:

• HILIC/FLD: Agilent 1260 Infinity II, kolonka AdvanceBio Glycan Mapping 2.1×150 mm, 2.7 µm
• Mobilní fáze: A) 50 mM ammonium formát pH 4.4, B) acetonitril; gradient 27→62 % B v 30 min
• Detekce FLD: λEx 285 nm, λEm 345 nm
• Kalibrace: InstantPC Maltodextrin ladder, 5. řádový polynom pro převod retenčního času na GU

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow umožňuje kompletní přípravu a analýzu N-glykanů z IgG za méně než 60 minut. HILIC/FLD chromatogram ukazuje dobře rozlišené špičky s hlavními strukturami: FA2G1 (24,7 %), FA2 (18,1 %), FA2G2 (12,9 %), FA2G2S1 (11,3 %) a další. Sekvenční exoglykozidázová digesce potvrdila přidělení jednotlivých glykanů a demonstrovala prediktabilní posuny špiček.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a plně automatizovatelnou přípravu v 96-jamkové formě
• Vysokou citlivost a reprodukovatelnost
• Okamžitou analýzu bez nutnosti dalšího soustředění
• Možnost rutinního monitoringu CQA glykozylace bioterapeutik

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Zkrácení analytických běhů pro jednodušší glykokompozice
• Přímá integrace s hmotnostní spektrometrií pro hlubší strukturální analýzu
• Úplná automatizace přípravy i analýzy v rámci high-throughput platforem
• Aplikace v objevování glykotypy jako biomarkerů a v personalizované medicíně

Závěr

Popsaná AdvanceBio Gly-X N-glycan prep s InstantPC představuje robustní a citlivou metodu pro high-throughput přípravu a HILIC/FLD profilování N-glykanů. Workflow trvá méně než hodinu, poskytuje vynikající rozlišení a spolehlivou validaci struktur pomocí exoglykozidáz.

Reference

• Hebert D. N. The Intrinsic and Extrinsic Effects of N-Linked Glycans on Glycoproteostasis. Nat. Chem. Biol. 2014, 10(11), 902–910.
• Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. J. Pharm. Sci. 2015, 104(6), 1866–1884.
• Melmer M. HILIC Analysis of Fluorescence-Labeled N-Glycans from Recombinant Biopharmaceuticals. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 398, 905–914.
• Ruhaak L. R. Glycan Labeling Strategies and Their Use in Identification and Quantification. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397, 3457–3481.
• Xie Y.; High-Throughput and High-Sensitivity N-Glycan Profiling: a Platform for Biopharmaceutical Development and Disease Biomarker Discovery. Anal. Biochem. (rok neuveden).