Workflows for N-Glycan Analysis of Biotherapeutics Using LC/FLD/MS

Význam tématu

Analýza N-glykosidických řetězců je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality glykoproteinů používaných jako bioterapeutika. Struktura a složení těchto oligosacharidů ovlivňuje farmakokinetiku, farmakodynamiku, imunogenicitu a stabilitu léčiv. Stanovení glykosylačního profilu je často vyžadováno jako kritický atribut kvality (CQA) i pro produkty, u nichž glykozylace není primárním CQA.

Cíle a přehled studie

Webinář shrnuje komplexní workflow pro uvolnění, značení, separaci a detekci N-glykosidů z bioterapeutik. Představuje volbu barevné značky (InstantPC, 2-AB, APTS), postupy pro hydrofobně-interakční chromatografii (HILIC), detekci fluorescencí a hmotnostní spektrometrií a kvantifikaci sialových zbytků.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 1–100 µg glykoproteinu (mAb, Fc-fúzní proteiny, EPO aj.).
• Deglykosylace: rychlá in-solution denaturace při 90 °C po dobu 3 min a enzymatická uvolnění N-glykosidů PNGasa F (5 min).
• Značení: InstantPC (45–120 min), 2-AB Express (2 hodiny), APTS Express pro capilární elektroforézu (2 hodiny).
• Čištění: snadná on-matrix exkstrakce bez sušení.
• Separace: UHPLC-HILIC na AdvanceBio Glycan Mapping kolonkách (1.8–2.7 µm) s gradientem acetonitrilu/amonného formiátu.
• Detekce: fluorescenční detektor (ex/em 285/345 nm pro IPC; 260/430 nm pro 2-AB; APTS pro CE) a Q-TOF MS (pozitivní ionizační mód).
• Sialová analýza: mikrotitrační kinetický kit (fluorescenční čtení, ex 530/nm em 590 nm) pro total sialic acid quantitation (40–1 000 pmol).

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow Gly-X dosahuje >99 % uvolnění N-glykosidů u mAb (Rituximab, Cetuximab) a Fc-fúzních proteinů (Enbrel). InstantPC poskytuje výrazný nárůst signálu ve fluorescenci i MS oproti 2-AB. Separace ukázala rozlišení isomerů α(2,3) vs. α(2,6) sialylace. 2-AB Express workflow zajišťuje srovnatelné kvantitativní výsledky se standardními metodami. APTS Express umožňuje vysokopropustnou CE analýzu. Celková opakovatelnost kvantifikace sialových zbytků byla pod 3 % CV v rámci jedné série a pod 10 % mezi operátory.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby přípravy vzorku (45 min–2 hod), snadná automatizace a vysoká propustnost.
• Široká škála značek pro různé detekční systémy (FLD, MS, CE) a kompatibilita s historickými daty (2-AB).
• Spolehlivá identifikace a kvantifikace glykánů a sialové hustoty jako CQA.
• Možnost rozlišení biologicky významných isomerů a detekce imunogenních struktur (α-Gal, NeuGc).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj rychlých in-solution enzymatických protokolů, zlepšení citlivosti barevného značení a integrace do plně automatizovaných platforem. Metody rezonance párových iontů a ion mobility MS mohou doplnit strukturální charakterizaci. Vznikají standardizované glykomické knihovny pro přesnou identifikaci glykánů z různých expresních systémů a variant modelových proteinů.

Závěr

Popsané workflow spojuje rychlou přípravu vzorku, volbu značky a vysoce výkonnou separaci s hmotnostní spektrometrií pro robustní analýzu N-glykosidů u bioterapeutik. Přináší výrazné zkrácení času, vysokou reproducibilitu a univerzální využití v R&D, QA/QC i klinické vývojové fázi.

Reference

Khoury J. et al. Nat Sci Rep. 2011;1:90.
Planinc A. et al. Anal Chim Acta. 2016;921:13–27.
Walsh G. Nat Biotechnol. 2014;32(10):992–1000.
Liu Y. J Pharm Sci. 2015;104(6):1866–1884.
Jones AL. BioPharm Intl. 2017;30:20–25.
Higel F. et al. Eur J Pharm Biopharm. 2016;100:94.
Abes R., Teillaud JL. Pharmaceuticals. 2010;3:146–157.
Chung CH. et al. N Engl J Med. 2008;358(11):1109–1117.
Ghaderi D. et al. Biotechnol Genet Eng Rev. 2012;28:147–175.
Anthony RM. et al. Science. 2008;320(5874):373–376.
Lee EU. et al. J Biol Chem. 1989;264(23):13848–13855.
Raymond C. et al. mAbs. 2015;7(3):571–583.
Technical Note 5994-0999EN, 5991-8550EN, 5991-8071EN, 5991-6958EN; ProZyme TN4010, TN4003; ASMS poster ThP697.