High-Throughput N-Glycans Profiling of Monoclonal Antibodies EG2-hFc and Rituximab Using the Agilent AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep with InstantPC Kit

Význam tématu

Glykozylace je klíčová posttranslační úprava terapeutických proteinů, ovlivňující jejich stabilitu, farmakokinetiku, imunitní odpověď a funkci. Heterogenita glykoproteinových struktur je považována za kritický atribut kvality (CQA) a vyžaduje rutinní sledování pro zajištění bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Studie představuje použití Agilent AdvanceBio Gly-X N-glycan Prep s InstantPC kity pro expresní uvolnění a značení N-glykanů z monoklonálních protilátek EG2-hFc a rituximab. Hlavním cílem je ukázat možnost zkrácení přípravy na méně než jednu hodinu při zachování vysoké citlivosti a reprodukovatelnosti v režimu 96-jamkové desky.

Použitá metodika a instrumentace

• Denaturace: 2 µL denaturačního činidla, 90 °C, 3 minuty.
• Deglykozylace: 2 µL N-glykanasy, 50 °C, 5 minut.
• Derivatizace: 5 µL InstantPC barviva, 50 °C, 1 minuta.
• Čištění: on-matrix očista v 96-jamkové destičce s Load/Wash roztokem (2,5 % kyseliny mravenčí, 97,5 % acetonitrilu).
• Analýza: HILIC-FLD na Agilent 1260 Infinity II s AdvanceBio Glycan Mapping column (2,1×150 mm, 2,7 µm), mobilní fáze 50 mM amonný formiát pH 4,4 (A) a acetonitril (B), detekční vlnové délky λEx 285/λEm 345 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Příprava glykanů byla dokončena za méně než 60 minut s vysokou citlivostí fluorescence. U EG2-hFc dominovaly neutralní biantennární glykany s jádrovou fukosylací: FA2G2 (33,1 %), FA2G1 (27,2 %), FA2G2S1 (14,3 %), FA2 (9,9 %) a FA2G2S2 (9,2 %). Rituximab ukázal nejvyšší podíl FA2 (40,2 %), FA2G1 (35,7 %), FA2G2 (10,7 %) a low-manózové druhy M5–M7 (celkem ~7,5 %). Metoda vykázala dobré rozlišení klíčových glykanů, reprodukovatelné retenční časy a lineární odezvu v kvantifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby přípravy glykanů (<1 h).
• Vysoká citlivost díky InstantPC fluorescenčnímu značení.
• Reprodukovatelné výsledky v režimu 96-jamkové destičky pro vysokou propustnost.
• Snadná adaptace na existující LC/FLD či LC/MS laboratoře bez zásadních úprav.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze dále rozšířit o hmotnostní spektrometrii pro strukturální potvrzení a detailní identifikaci isobarických glykanů. Integrace automatizovaných robotických stanic zkrátí manuální kroky a zvýší výrobní propustnost. Rozvoj bioinformatických nástrojů urychlí zpracování dat a usnadní srovnávací analýzy glykoform.

Závěr

Agilent AdvanceBio Gly-X s InstantPC nabízí robustní, rychlý a citlivý workflow pro profilování N-glykanů u monoklonálních protilátek. Přináší významné zkrácení času přípravy, vysokou reprodukovatelnost a snadnou implementaci do rutinního QC i vývojových laboratoří v biotechnologickém průmyslu.

Reference

1. Bairoch A, Apweiler R. The SWISS-PROT Protein Sequence Database and Its Supplement TrEMBL in 2000. Nucleic Acids Res. 2000;28:45–48.
2. Apweiler R, Hermjakob H, Sharon N. On the Frequency of Protein Glycosylation, as Deduced from Analysis of the SWISS-PROT Database. Biochim Biophys Acta. 1999;1473:4–8.
3. Khoury GA, Baliban RC, Floudas CA. Proteome-Wide Post-Translational Modification Statistics: Frequency Analysis and Curation of the Swiss-Prot Database. Sci Rep. 2011;1:90.
4. Zhou Q, Qiu H. The Mechanistic Impact of N-Glycosylation on Stability, Pharmacokinetics, and Immunogenicity of Therapeutic Proteins. J Pharm Sci. 2019;108(5):1366–1377.
5. Wada R, Matsui M, Kawasaki N. Influence of N-Glycosylation on Effector Functions and Thermal Stability of Glycoengineered IgG1 Monoclonal Antibody with Homogeneous Glycoforms. MAbs. 2019;11(2):350–372.
6. Higel F et al. N-glycosylation Heterogeneity and the Influence on Structure, Function and Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies and Fc Fusion Proteins. Eur J Pharm Biopharm. 2016;100:94–100.
7. Delobel A. Glycosylation of Therapeutic Proteins: A Critical Quality Attribute. Methods Mol Biol. 2021;2271:1–21.
8. Goh JB, Ng SK. Impact of Host Cell Line Choice on Glycan Profile. Crit Rev Biotechnol. 2018;38(6):851–867.
9. Hossler P, Khattak SF, Li ZJ. Optimal and Consistent Protein Glycosylation in Mammalian Cell Culture. Glycobiology. 2009;19(9):936–949.
10. Zhang P et al. Challenges of Glycosylation Analysis and Control: an Integrated Approach to Producing Optimal and Consistent Therapeutic Drugs. Drug Discov Today. 2016;21(5):740–765.
11. Xie Y et al. High-throughput and High-Sensitivity N-Glycan Profiling: a Platform for Biopharmaceutical Development and Disease Biomarker Discovery. Anal Biochem. 2021;623:114205.
12. Pierpont TM, Limper CB, Richards KL. Past, Present, and Future of Rituximab – The World's First Oncology Monoclonal Antibody Therapy. Front Oncol. 2018;8:163.
13. Yan J et al. Streamlined Workflows for N-Glycan Analysis of Biotherapeutics Using Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC and 2-AB Express Sample Preparation with LC/FLD/MS. Agilent Technologies application note 5994-1348EN. 2019.
14. Liau B. A Comparative Study of the Intact Mass, Subunit Mass, and Released Glycans of Two Rituximab Biosimilars Using High-Resolution LC/MS. Agilent Technologies application note 5994-1653EN. 2020.