N-Glycan Analysis: Better Together - Agilent and ProZyme sample preparation workflow

Význam tématu

Charakterizace N-glykanů je klíčová pro vývoj bioterapeutik, jako jsou monoklonální protilátky a Fc fúzní proteiny. Struktura připojených sacharidů ovlivňuje imunogenicitu, farmakokinetiku a farmakodynamiku léčivých proteinů. Precizní analýza uvolněných N-glykanů tak zajišťuje konzistentní kvalitu a bezpečnost finálních produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje integrované pracovní postupy Agilent a ProZyme pro přípravu, separaci a detekci N-glykanů. Klíčovým cílem je nabídnout modulární a škálovatelná řešení zkracující dobu přípravy vzorku, zvyšující citlivost a podporující vysokou propustnost vyšetření.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky glykoproteinů se denaturují a enzymaticky ošetřují PNGase F pro uvolnění N-glykanů. Uvolněné sacharidy se označí fluorescenčně či pomocí InstantPC barviv a poté se odstraní přebytečné činidlo vakuovou desku. Rozlišování probíhá hydrofobně-interakční HILIC chromatografií nebo kapilární elektroforézou, s detekcí FLD a poté potvrzením molekulové hmotnosti MS.

• Enzymatická deglykosylace: PNGase F, Endo H, Endo F2
• Fluorescenční značení: InstantPC, 2-AB, APTS
• HILIC separace: AdvanceBio Glycan Mapping columns (1,8 µm a 2,7 µm)
• Kapilární elektroforéza: APTS Express
• Detekce MS: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF, MassHunter BioConfirm
• Automatizace: AssayMAP Bravo, vakuová 96-destička

Hlavní výsledky a diskuse

Nová platforma Gly-X umožňuje kompletní přípravu označených N-glykanů během jedné hodiny s vysokou reprodukovatelností (CV < 3 %). Porovnání fluorescenčního a MS signálu ukázalo u InstantPC až trojnásobně vyšší citlivost oproti tradičnímu 2-AB značení. Sloupce AdvanceBio Glycan Mapping zaručují rychlou separaci i složitých izomerů s vynikajícím rozlišením.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby přípravy vzorku z dní na hodiny
• Unifikované workflow podporující různá barviva i instrumenty
• Vysoká citlivost FLD i MS detekce pro stopové složky
• Možnost automatizace procesů v 96-destičkovém formátu
• Široká nabídka standardů a enzymů pro potvrzení a úpravu glykanových struktur

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj rychlých chemických značení s vyššími signálními intenzitami a širší podpory pro auto­matizované platformy. Integrace glyko­inženýrských enzymů umožní modulární úpravy glykosidických vzorců přímo ve workflows. Vzrůst stále dostupnějších glyko­databází a AI nástrojů pak zjednoduší interpretaci komplexních profilů sacharidů.

Závěr

Integrovaná řešení Agilent a ProZyme posouvají analýzu N-glykanů nových bioterapeutik na vyšší úroveň. Modularita, vysoká propustnost a citlivost umožňují rychlé a spolehlivé sledování kvality glykoformy během vývoje a výroby.

Reference

1. Jones A. N-Glycan Analysis of Biotherapeutic Proteins. BioPharm Int. 2017;30(6):20–25.
2. Planinc A. et al. Glycan characterization of biopharmaceuticals: Updates and perspectives. Anal Chim Acta. 2016;921:13–27.
3. Szekrényes Á. et al. Multi-site N-Glycan Mapping study 2: UHPLC. Electrophoresis. 2018;39(7):998–1005.
4. Szekrényes Á. et al. Multi-site N-Glycan Mapping study 1: CE-LIF. MAbs. 2016;8(1):56–64.
5. Yan J. et al. Comparison of Common Fluorescent Labels for LC/MS Analysis of Released N-Linked Glycans. Agilent app. note 5994-0942EN. 2019.
6. Lee EU. et al. Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of CHO cells. J Biol Chem. 1989;264(23):13848–55.
7. Anthony RM. et al. Recapitulation of IVIG anti-inflammatory activity with a recombinant IgG Fc. Science. 2008;320(5874):373–6.
8. Raymond C. et al. Production of α2,6-sialylated IgG1 in CHO cells. MAbs. 2015;7(3):571–83.
9. Varki A. et al. Symbol Nomenclature for Graphical Representations of Glycans. Glycobiology. 2015;25(12):1323–4.
10. Ceroni A. et al. GlycoWorkbench: annotation of glycan mass spectra. J Proteome Res. 2008;7(4):1650–9.