Extraction of Vitamin B7 (Biotin) from Serum Using EVOLUTE® EXPRESS ABN Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Vitamin B7 (biotin) je nezbytný vodou rozpustný vitamín působící jako koenzym v mnoha metabolických drahách. Jeho kvantifikace v lidském séru je důležitá pro diagnostiku výživových a patologických stavů i pro kontrolu kvality ve farmaceutickém a biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout automatizovatelný, reprodukovatelný a vysoce čistý postup extrakce biotinu ze séra pomocí sorbentu EVOLUTE EXPRESS ABN a následné stanovení koncentrace metodou LC-MS/MS při minimálních matricových interferencích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: 200 µl lidského séra doplněného deuterovaným interním standardem (Biotin-[2H2]) 250 pg/ml a naředěného 1 % kyselinou mravenčí (200 µl).

SPE pomocí EVOLUTE EXPRESS ABN 10 mg 96-well desky:

• Volitelná kondice: methanol (500 µl) a 1 % kyselina mravenčí (500 µl).
• Naložení vzorku: 400 µl předúpravy.
• Dvě fáze praní: voda (500 µl), voda/metanol 95:5 (500 µl).
• Eluce: 0,1 % NH4OH v H2O/MeOH 90:10 (200 µl).
• Evaporace do sucha při 40 °C.
• Rekonstrukce v H2O/ACN 90:10 (200 µl).

Chromatografické podmínky UPLC:

• Souprava: Waters ACQUITY I-Class s ACE Excel C18-PFP kolonkou (100×2,1 mm, 1,7 µm).
• Fáze A: 1 mM amonný fluorid ve vodě, fáze B: acetonitril.
• Gradient: 0–1,5 min 90→82 % A, 1,5–2,0 min 82→20 % A, 2,0–2,6 min návrat na 90 % A.
• Průtok 0,4 ml/min, objem injekce 10 µl, column temp. 40 °C, autosampler 20 °C.

MS/MS podmínky:

• Přístroj: Waters Xevo TQ-S, ESI v negativním módu.
• Detekce MRM: biotin kvalifikace 243,1>200,0; kvantifikace 243,1>166,0; interní standard 245,1>168,0; cone 25 V, collision 15 eV.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla extrakčních výtěžků nad 80 % se SSV < 10 % v rozsahu 25–5000 pg/ml. Kalibrační křivky v sérovém matrice (25–1000 pg/ml) vykázaly lineárnost r2 > 0,99. Účinnost odstraňování fosfolipidů byla potvrzena monitoringem typických iontů m/z 184 a testy post-column infusion ukázaly minimální supresi v retenčním intervalu ~0,8 min.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda je rychlá (přibližně 30 min na 96 vzorků), vysoce čistá, plně automatizovatelná na platformě Biotage Extrahera, ideální pro klinické laboratoře i QA/QC rutiny. Výsledné extrakty mají nízký podíl bílkovin, lipidů a fosfolipidů, což zlepšuje stabilitu a spolehlivost LC-MS/MS analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pH-stabilních kolonek pro přímou injekci bez evaporace.
• Minimalizace objemu elučního roztoku a rozšíření na microflow platformy.
• Adaptace protokolu na další polarické vitamíny a biomarkery.
• Plná automatizace v rámci laboratorních robotických linek.

Závěr

Optimalizovaný postup SPE na bázi EVOLUTE EXPRESS ABN ve spojení s LC-MS/MS nabízí robustní a citlivou platformu pro stanovení biotinu v séru s vysokou reprodukovatelností a minimálními matricovými efekty. Metoda je vhodná pro rutinní analýzy v klinických a průmyslových laboratořích.

Reference

• Biotage. Application Note AN880: Extraction of Vitamin B7 (Biotin) from Serum Using EVOLUTE EXPRESS ABN Prior to LC-MS/MS Analysis, 2017.