Extraction of 25-hydroxy Vitamin D from Serum Using ISOLUTE® PLD+ Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Stanovení 25-hydroxy vitaminu D v séru je klíčové pro hodnocení vitaminového stavu pacienta a diagnostiku deficitů. Přesná a reprodukovatelná metodika s nízkým pozadím od proteinů a fosfolipidů je zásadní pro klinickou i průmyslovou bioanalytiku.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo uvést rychlý, reprodukovatelný protokol extrakce 25-hydroxy vitaminu D2 a D3 ze séra pomocí destiček ISOLUTE PLD+ a následné kvantifikace metodou LC-MS/MS. Studie demonstruje výtěžnost, čistotu extraktů a kvalitu chromatografie.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky séra byly zpracovány na destičce ISOLUTE PLD+ pro simultánní odstranění proteinů a fosfolipidů:

• Přidání interního standardu d6-25-OH D3 (10 µL, 30 ng/mL).
• Srážení proteinů 400 µL acetonitrilu (MeCN) a 100 µL séra.
• Filtrace vakuem (–0,2 bar) nebo pozitivním tlakem (3 psi).
• Sušení extraktu pomocí SPE Dry (40 °C, 40 L/min) nebo TurboVap (40 °C, 1 bar).
• Rekonce ntrace v 100 µL 30/70 2 mM amonného formiátu s 0,1 % kyseliny mravenčí v MeOH–voda.

Analytická instrumentace:

• UPLC: Waters Acquity s kolonkou ACE EXCEL 2 C18-PFP (100×2,1 mm, 2 µm). Gradient 25→0→100→25 % fáze A/B (0,4 mL/min) v čase 0–4 min.
• MS/MS: Waters Quattro Premier XE, ESI pozitivní režim, MRM přechody 395,5>269,5 pro 25-OH D2, 383,5>257,5 pro 25-OH D3 a 389,6>263,5 pro ISTD; desolvace 450 °C, ion source 150 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografická separace obou forem 25-OH D byla dosažena za méně než 3 minuty. Recoveries při koncentracích 2–100 ng/mL překročily 70 % s RSD <10 %. Kalibrační křivky v PBS/BSA i v Chromsystems kalibrované sérii vykázaly r2 >0,99. DEQAS externí kontrola prokázala, že výsledky spadají do ±25 % ALTM u 100 % vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol umožňuje vysokou propustnost (96 jamková destička), výrazně snižuje interferences z proteinů a fosfolipidů a zkracuje dobu analýzy, což je výhodné pro rutinní klinické laboratoře a farmaceutický průmysl.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace na platformách jako Biotage Extrahera pro zvýšení reproducibility a throughputu.
• Rozšíření přístupu pro stanovení dalších vitaminů a bioaktivních lipidů ve více maticích.
• Integrace s multiplexními metodami pro souběžné kvantifikace řady analy­tů.

Závěr

Popsaný protokol s využitím ISOLUTE PLD+ destiček a LC-MS/MS nabízí rychlé, spolehlivé a vysoce čisté stanovení 25-hydroxy vitaminu D v séru. Metoda splňuje požadavky na přesnost a reprodukovatelnost potřebné pro klinické i výzkumné aplikace.