Extraction of Urinary Catecholamines and Metanephrines Using EVOLUTE® EXPRESS WCX SPE Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Analýza katecholaminů a jejich metabolitů v moči, konkrétně epinefrinu, norepinefrinu, dopaminu a jejich metylovaných analogů (metanefriny), je klíčová pro diagnostiku a monitorování neuroendokrinních poruch, jako jsou feochromocytom či paragangliom. Kvantifikace těchto látek přispívá k přesnějšímu určení hormonálních abnormalit a zlepšení klinického rozhodování.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat rychlý, reprodukovatelný postup pevné fáze SPE (Solid Phase Extraction) ve formátu load-wash-elute pomocí sorbentu EVOLUTE EXPRESS WCX pro extrakci katecholaminů a metanephrinů z moči před LC-MS/MS analýzou. Metoda se zaměřila na eliminaci kroků kondicionování a ekvilibrace, zvýšení laboratorní propustnosti a zachování vysoké výtěžnosti a lineárnosti kvantifikace.

Použitá metodika

Pro přípravu vzorku se 75 µL moči promíchalo s 10 µL interního standardu a 150 µL 250 mM roztoku octanu amonného. Následovalo nanesení na 96-destičku EVOLUTE EXPRESS WCX a definovaný load-wash-elute protokol:

• Load: 150 µL naloženého vzorku při 0–0,7 bar.
• Wash 1: 500 µL 10 mM octanu amonného pro odstranění polárních interferencí.
• Wash 2: 500 µL isopropanolu, po němž následuje sušení destičky (50 psi, 1 min).
• Eluce: 125 µL směsi vody/isopropanolu (85:15, v/v) s 0,1 % formátovou kyselinou.

Po SPE se eluát přímo analyzoval UHPLC-MS/MS, čímž odpadl časově náročný krok odpařování.

Použitá instrumentace

• SPE: EVOLUTE EXPRESS WCX 10 mg 96-well plate (Biotage 602-0010-PX01).
• Manifolduje: Biotage PRESSURE+ 96 positive pressure manifold nebo Biotage Extrahera™ automace.
• UHPLC: Shimadzu Nexera s kolonkou ACE Excel 1.7 µm C18-PFP (100 × 2,1 mm).
• MS/MS: AB Sciex 5500 s MRM kvantifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

Extrakční výtěžnosti při nejvyšších kalibračních koncentracích dosáhly 70–94 % s RSD pod 8 % pro load-wash-elute protokol. Linearita metody byla pro různé analyty ověřena v rozsahu 0,1–625 ng/mL s korelačními koeficienty r2 nad 0,99. Manuální i automatizované SPE prokázalo srovnatelné výsledky, přičemž load-wash-elute formát výrazně zkracuje dobu přípravy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysokou propustnost vzorků (až 96 vzorků za přibližně 50 min), minimalizuje spotřebu reagencií a eliminuje kroky kondicionování a ekvilibrace. Přímá eluce bez odpařování zkracuje čas přípravy a snižuje riziko ztrát nestabilních analyzovaných látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může spočívat v rozšíření na jiné biologické matrice (plazma/sérum), integraci úplné automatizace s vysokotlakými hlavami a aplikaci na vysokopropustné klinické laboratoře. Adaptace gradientu UHPLC pro lepší rozlišení je možná, stejně jako využití metody pro sledování farmakokinetiky adrenalinu a dopaminu.

Závěr

Vyvinutý SPE load-wash-elute postup s EVOLUTE EXPRESS WCX nabízí jednoduchou, rychlou a spolehlivou analýzu urinárních katecholaminů a metanephrinů. Metoda plně vyhovuje požadavkům vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a propustnosti pro rutinní klinickou a výzkumnou praxi.

Reference