Ultra-Sensitive Method for the Determination of 1,25 di-OH Vitamin D2 and 1,25 di-OH Vitamin D3 in Serum Using Supported Liquid Extraction Prior to LC-MS/MS

Význam tématu

Analýza 1,25 dihydroxyvitaminu D2 a D3 hraje zásadní roli při hodnocení biologické aktivity těchto hormonálně aktivních metabolitů v klinických a výzkumných laboratořích. Nízké koncentrace v séru (řádově pg/mL) vyžadují metody s velmi vysokou citlivostí, přesností a reprodukovatelností. Metoda založená na podporované kapalné extrakci (SLE) a LC-MS/MS detekci po PTAD derivatizaci poskytuje robustní přístup pro spolehlivé stanovení těchto látek ve fyziologických vzorcích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout a validovat ultra-citlivní postup pro stanovení 1,25 di-OH vitaminu D2 a D3 v lidském séru. Studie demonstrovala:

• efektivní extrakci analyzovaných látek pomocí ISOLUTE SLE+ destiček,
• derivatizaci PTAD a tvorbu methylamino komplexu pro zvýšení citlivosti,
• kvantifikaci metodou LC-MS/MS v lineárním rozsahu 5–500 pg/mL se standardním objemem 0,25 mL séra.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: 250 µL séra smícháno s interním standardem (deuterovaný 1,25 di-OH D3), proteinová vazba narušena 50% propan-2-olem.
• Štěpení proteinu: inkubace 30 min, následné naložení 300 µL vzorku na SLE destičku pod gravitačním tlakem.
• Derivatizace: eluát zachycen v destičce s 200 µL PTAD v heptanu:ethylacetátu, inkubace 30–60 min.
• Evaporace a rekonstituce: sušení při 40 °C, rekonstituce v 70% methanolu s methylaminem.
• LC-MS/MS: UHPLC Shimadzu Nexera se sloupcem C18, izokratický tok acetonitril:voda 50:50 s methylaminem, detekce AB Sciex 5500 v režimu MRM.

Hlavní výsledky a diskuse

• Extraktční výtěžky: 1,25 di-OH D2 104,3 % (RSD 3,2 %), 1,25 di-OH D3 99,3 % (RSD 3,6 %).
• Lineárnost: koeficienty korelace >0,994 v rozsahu 5–500 pg/mL s vážením 1/x.
• Citlivost: spodní mez stanovitelnosti ~5 pg/mL za podmínek použití vyčištěného séra.
• Selektivita: žádná vzájemná interferenční reakce se 24,25 di-OH D3; vysoká specifita PTAD-methylaminového komplexu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou přesnost a reprodukovatelnost při nízkém odběrovém objemu séra. Díky jednoduché SLE extrakci a in-line derivatizaci je workflow rychlé a snadno automatizovatelné, což zkracuje dobu přípravy vzorků a minimalizuje riziko emulzí či ztrát analyzovaných látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorku na platformách typu Biotage Extrahera pro zvýšení propustnosti laboratoře.
• Rozšíření metody o simultánní stanovení mono-OH vitaminů D (25-OH D2 a D3) s úpravou kalibrace.
• Implementace vyšších pH mobilní fáze pro optimum separace derivatizovaných komplexů a zkrácení doby analýzy.
• Využití PTAD derivatizace pro sledování dalších nízkomolekulárních metabolitů v bioanalýze.

Závěr

Vyvinutá metoda SLE / PTAD derivatizace a LC-MS/MS poskytuje spolehlivé stanovení 1,25 di-OH vitaminu D2 a D3 s vysokou citlivostí, selektivitou a reprodukovatelností. Díky nízkému objemu vzorku a rychlému postupu je vhodná pro klinické a výzkumné aplikace, kde je klíčová precizní kvantifikace těchto hormonálně aktivních metabolitů.

Reference

• Biotage Application Note AN857, Ultra-Sensitive Method for the Determination of 1,25 di-OH Vitamin D2 and D3, 2015.