Extraction of Fat-Soluble Vitamins from Human Serum Using ISOLUTE® SLE+ Prior to UHPLC/MS-MS Analysis

Význam tématu

Kvantifikace tukově rozpustných vitaminů (A, D, E, K) v lidském séru je klíčová pro hodnocení nutričního stavu a diagnózu různých onemocnění. Robustní a reprodukovatelná metoda extrakce a analýzy je nezbytná pro spolehlivé výsledky v klinických i výzkumných laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku bylo vyvinout a validovat jednoduchý postup extrakce vitamínů A (retinol, beta-karoten), D2/D3 (25-OH), E (alfa-tokoferol) a K (fyllochinon, menachinon-4) z lidského séra pomocí ISOLUTE SLE+ před následnou UHPLC-MS/MS analýzou. Studie zahrnovala optimalizaci předúpravy, kalibrace, posouzení zotavení a přenos do automatizovaného režimu.

Použitá metodika

• Předúprava: Do 100 µl séra se přidalo 10 µl vnitřního standardu (D6 25-OH D3) a 10 µl spiking nebo kontrolního roztoku, inkubace ve tmě 1 h.
• Podpora SLE+: K vzorku se přidalo 400 µl pre-treatment solvent (IPA/heptan), vznik emulze mícháním v pipetě, nasazení na SLE 400 µl destilační destičky a rovnovážení 5 min.
• Eluce: 2×500 µl heptanu, sběr eluátu do kolekční destičky.
• Sušení: Proud vzduchu nebo dusíku, rekonstituce v 150 µl IPA s BHT.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Waters Acquity UPLC s kolonkou Restek Raptor Biphenyl (100×2,1 mm, 2,7 µm), gradientní eluce mobile phase A (5 mM acetát amonný/0,1 % kys. mravenčí ve vodě) a B (methanol:propan-2-ol 3:1 s 5 mM acetátem amonným a 0,1 % kys. mravenčí).
• MS/MS: Waters Quattro Premier XE, ESI v pozitivním módu, MRM tran­sice optimalizované pro jednotlivé vitaminy.
• Automatizace: Biotage Extrahera™ nebo ruční PRESSURE+ 96 manifold pro SLE extrakci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Manuální extrakce dosáhla zotavení ≥ 90 % (RSD < 10 %), automatizace mírně snížila recoveries na 71–82 %.
• Lineární kalibrace s r2 > 0,99 v rozsazích: E (0,8–40 µg/mL), A (0,08–4 µg/mL), D2/D3 (4–200 ng/mL), K (0,4–20 ng/mL).
• LOQ spadají do klinicky relevantních hodnot s dostatečnou citlivostí.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá, jednoduchá předúprava s nízkou spotřebou vzorku (100 µl séra).
• Čisté extrakty prodlužují životnost LC-MS kolony a snižují údržbu.
• Kompatibilní s vysokopropustnými a automatizovanými systémy v rutině QA/QC a výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu o další tukově rozpustné metabolity a karotenoidy.
• Nasazení dalších izotopových standardů pro vitaminy K.
• Integrace online SPE a ultrarychlých kolonek pro zkrácení doby analýzy.
• Využití vysoce citlivých MS systémů pro detekci stopových koncentrací.

Závěr

Navržená metoda SLE+ ve spojení s UHPLC-MS/MS poskytuje spolehlivou kvantifikaci vitaminů A, D, E a K v lidském séru s vysokým zotavením i reprodukovatelností a je vhodná pro manuální i plně automatizované zpracování.

Reference

• Biotage. Application Note AN945. Extraction of Fat-Soluble Vitamins from Human Serum Using ISOLUTE SLE+ Prior to UHPLC/MS-MS Analysis. 2020.