Extraction of a Drugs of Abuse Panel from Whole Blood Using ISOLUTE® SLE+ Prior to UPLC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Analýza léků zneužívaných jako drogy v celém krevním vzorku je klíčová pro forenzní toxikologii, klinická vyšetření a monitorování zneužívání léků. Rychlá, spolehlivá a vysoce citlivá příprava vzorku pomáhá zajistit přesné stanovení nízkých koncentrací široké škály drog v komplexním biologickém matrice bez vzniku emulzí a s vysokou opakovatelností měření.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo optimalizovat a validovat protokol založený na podpoře kapalného extrakčního média ISOLUTE SLE+ pro izolaci 49 léků a metabolitů ze vzorku 500 µl celkové krve. Extrakty byly následně analyzovány pomocí UPLC-MS/MS v režimu vícečetného monitorování (MRM) s důrazem na dosažení nízkých limitů kvantifikace a vysoké reprodukovatelnosti v rozsahu 10 ng/ml a výše.

Použitá instrumentace

• ISOLUTE SLE+ 1 ml kolonky (Biotage, kat. č. 820-0140-C)
• Biotage Extrahera™ Automation System pro automatizaci přípravy vzorků
• TurboVap LV (Biotage) pro odpařování extraktů
• Waters ACQUITY UPLC s 20 µl oběžnou petlí
• Restek Raptor Biphenyl 2,7 µm (100 × 2,1 mm) kolona s EXP guard cartridge
• Waters Premier XE Tříčtvrlečníkový hmotnostní spektrometr s elektrospray ionizací

Použitá metodika

Vzorek 500 µl krve byl obohacen o vnitřní standardy a upraven 0,1 % hydroxidem amonným. Po absorpci matrice na SLE+ kolonce byl analyzát extrahován sekvenčním dávkováním DCM/IPA (95:5) a tří frakcí MTBE, vždy pod gravitačním protlačením a krátkým vakuovým impulzem. Extrakt byl sbírán do roztoku 50 mM HCl v methanolu, vysušen proudem vzduchu nebo dusíku a rekonstituován mobilem B (methanol s 2 mM formiátu amonného a 0,1 % kyseliny formiové) a mobilem A (voda s 2 mM formiátu amonného a 0,1 % kyseliny formiové). Chromatografické rozlišení proběhlo gradientem od 5 % do 100 % methanolu při 0,4 ml/min na biphenylové koloně při 40 °C. Detekce MRM monitorovala optimální přechody jednotlivých analyzátů.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro většinu léků byla dosažena extrakční účinnost nad 85 % a relativní standardní odchylky pod 10 %. Limity kvantifikace se pohybovaly v rozsahu 0,007–5 ng/ml podle analyzované látky. Kalibrační křivky vykázaly koeficient determinace r2 > 0,99 i při pozorovaném kvadratickém chování některých látek při vyšších koncentracích. Analýza čistoty extraktů prokázala významné snížení signálu fosfolipidových přechodů ve srovnání s jednoduchou precipitací acetonitrilem.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje vysokou citlivost, robustnost a možnost plné automatizace. Odpadá riziko emulze spojené s klasickou LLE, zkracuje se doba přípravy a zlepšuje opakovatelnost. Provozní protokol je vhodný pro forenzní laboratoře, klinické studie a QA/QC aplikace, kde je vyžadován široký panel analytů a nízké meze detekce.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směřuje k miniaturizaci a integraci přípravy vzorků s online platformami, rozšíření panelu o nové metabolity a aplikaci na další biologické matricé. V horizontu vývoje AI podpora zpracování dat a adaptivní kalibrace umožní další zvýšení throughput a spolehlivosti výsledků.

Závěr

Optimalizovaný protokol s využitím ISOLUTE SLE+ a UPLC-MS/MS nabízí rychlou a spolehlivou extrakci širokého spektra drog z celkové krve s vysokou citlivostí a reprodukovatelností. Automatizovatelná workflow významně zkracuje čas analýzy a zvyšuje kvalitu výsledků.