Greener, Lower Cost Organic Mobile Phase Solvents for the LC-MS Analysis of Intact Biotherapeutic Proteins

Význam tématu

V oblasti biofarmaceutik hraje kvalita a konzistence analýzy intactních proteinů klíčovou roli pro vývoj a kontrolu léčiv. Tradičně používaný organický eluční prostředek acetonitril má třídu toxicity II, což zvyšuje náklady i ekologickou zátěž laboratoří. Náhrada za méně toxické a levnější alkoholy (metanol, isopropanol) podporuje udržitelné chromatografické postupy bez kompromisů ve výkonnosti LC-MS.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit, zda lze acetonitril nahradit izopropanol (IPA) nebo metanol (MeOH) při reverzní fázi LC-MS analýze intactních monoklonálních protilátek (mAb) a jejich subjednotek. Studie porovnávala chromatografické chování, citlivost, tvar špiček, účinnost desolvatace a výslednou kvalitu MS dat pro běžně používané podmínky (0,1 % kyseliny mravenčí).

Použitá metodika a instrumentace

Experimenty proběhly na systému BioAccord™, tvořeném:

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS (18 000 psi), teplota kolony 80 °C, průtok 0,4 mL/min.
• Kolona BioResolve RP mAb Polyphenyl, 450 Å, 2,7 µm, 2,1 × 50 mm.
• Detektory: tunable UV (TUV) 280 nm a ACQUITY RDa™ přesná hmotnost.
• Software: waters_connect v1.9.9.6.

Vzorky:

• Intact NISTmAb (0,2 µg/µL, injekce 4 µL).
• IdeS‐štěpené a redukované subjednotky mAb (0,1 µg/µL, injekce 4 µL).

Mobilní fáze:

• Fáze A: voda + 0,1 % formiové kyseliny.
• Fáze B: 0,1 % formiové kyseliny v 95 % ACN, MeOH nebo IPA.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografické profily intactních mAb ukázaly srovnatelné a symetrické špičky s šířkami 3,6 s (IPA), 3,6 s (ACN) a 4,8 s (MeOH). Citlivost TIC při použití MeOH dosahovala ~80 % hodnoty oproti ACN a IPA. MS spektra intactního mAb vykazovala u IPA a ACN nižší „valley“ mezi glykoformami (17 % vs. 20 % u MeOH), což svědčí o efektivnější desolvataci. Dekonvoluovaná data pro pět hlavních glykoform G0F/G0F až G2F/G2F prokázala obdobné relativní zastoupení a přesnost hmotnosti (< 15 ppm) ve všech třech systémech.
Subjednotková analýza (scFc, LC, Fd) za 5,5 min vykázala srovnatelnou separaci i MS odezvu. V porovnání s ACN měla IPA průměrnou TIC intenzitu 1,18× a MeOH 1,06×.
Výrazně vyšší viskozita IPA vedla k vyšším provozním tlakům (7 500 psi vs. 2 500–3 000 psi u ACN/MeOH), avšak při použití kolony 2,1 × 50 mm a 80 °C zůstaly tlaky v limitech UPLC.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení toxicitiy mobilní fáze (IPA třídy III vs. ACN třídy II).
• Nákladová úspora: cena IPA a MeOH je až třikrát nižší než u ACN.
• Porovnatelné chromatografické a hmotnostně spektrometrické parametry pro rutinní analýzu intactních proteinů i subjednotek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší adopce greener solventů v LC-MS, včetně optimalizace gradientů a rozšíření na další třídy biomolekul. Důraz se bude klást na další snížení environmentální stopy, validaci metod v regulovaném prostředí a zavedení alternativních kyselin pro zlepšení ionizace.

Závěr

Studie prokázala, že izopropanol je plnohodnotná alternativa acetonitrilu pro reverzní fázi LC-MS intactních bioterapeutik a jejich subjednotek. Podporuje snižování nákladů a toxicity bez ztráty analytické kvality, což otevírá cestu k udržitelnějším a efektivnějším bioanalytickým postupům.

Reference

1. Welch J. et al. Greening Analytical Chromatography. Trends Anal Chem, 29(7), 2010.
2. Yabré M. et al. Greening, Reversed-Phase LC Methods Using Alternative Solvents. Molecules, 23, 1065, 2018.
3. Funari C. et al. Acetone as a Greener Alternative to Acetonitrile. J Sep Sci, 38(9), 1441–1624, 2015.
4. FDA Q3C Tables and List Guidance for Industry, 2014.
5. Dillon T. et al. US2005O161399A1, 2005.
6. Waters. ACQUITY UPLC TUV Detector Operator’s Guide, 715004733, 2014.
7. Shion H. et al. Enabling Routine and Reproducible Intact Analysis. Waters App Note, 720006472, 2019.
8. Li J. et al. Selection of Solvents for HPLC UV Sensitivity. Anal Purif, 2(1):72–75, 1987.
9. Li J. et al. Signal-to-Noise Optimization in HPLC UV. LC-GC, 10(11):856–864, 1992.
10. Snyder L. et al. Practical HPLC Method Development, 2nd ed., pp.59–79, 722–726, 1997.