Intact & Subunit Analysis Using Reversed Phase - Agilent BioHPLC Columns Application Compendium

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují významnou třídu bioterapeutik s vysokou mírou komplexity. Jejich úplná charakterizace, zahrnující stanovení přesné molekulární hmotnosti, sledování glykozylace a dalších post-translačních modifikací, je nepostradatelná nejen pro vývoj a schvalování biologických léčiv, ale i pro kontrolu kvality v průmyslové výrobě.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikací a studií představených v tomto souhrnu je ukázat:

• Vývoj a optimalizaci reverzně-fázových metod pro analýzu intactních protilátek a jejich subjednotek.
• Implementaci vysoce účinných LC/Q-TOF systémů Agilent pro přesné měření hmotnosti intactních mAb a fragmentů.
• Automatizaci vzorkovacího protokolu pomocí platformy Agilent AssayMAP Bravo pro zvýšení reproducibility a zkrácení doby přípravy vzorků.
• Kompletní workflow od očištění protilátky po analýzu a automatizované zpracování dat s BioConfirm softwarem.

Použitá metodika a instrumentace

Reverzně-fázová chromatografie pod denaturačními podmínkami rozděluje protilátky podle hydrofobnosti za gradientního eluce organického činidla. Pro intactní protilátky a subjednotky se nejčastěji používají kolonové materiály:

• AdvanceBio RP-mAb (C4, SB-C8, diphenyl), Poroshell s 300–450 Å póry.
• PLRP-S (polymerní částice) pro lepší tvar piků v přítomnosti formiové kyseliny.

LC systémy: Agilent 1290 Infinity II UHPLC (tlak až 1200 bar), teplotní modul 60–90 °C. MS detekce: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual JetStream zdrojem, rozšířený rozsah až 10 000 m/z, referenční hmota 922,0098, rychlost 1 spektrum/s. BioConfirm software s dekonvolučním algoritmem Maximum Entropy zajišťuje automatické vyhodnocení a přesnost měření na úrovni jednotek ppm.

Pro automatizaci přípravy vzorků: Agilent AssayMAP Bravo

• SA-W (streptavidin) kazety pro imobilizaci biotinylovaných ligandů (HER2 ECD, Protein L).
• On-Cartridge Reaction: enzymatická reakce PNGase F (odhęlení glykanů), IdeS proteáza (rozštěpení na Fc a F(ab')₂), redukční činidlo TCEP pro oddělení lehkého a těžkého řetězce.

Hlavní výsledky a diskuse

• Purifikace intactních mAb z kultivačních médií pomocí specifické imobilizace na kazetách Bravo vedla k vysoce čistým vzorkům se zachovanou biologickou aktivitou.
• Rychlá LC separace intactních protilátek za 4–5 min s rozlišením hlavních glykoform (G0F, G1F, G2F) a hmotnostní přesností <1 ppm (NISTmAb).
• Subjednotková analýza (heavy/light chain, F(ab')₂, Fc) včetně rozlišení disulfidových forem: dvojné intra-i inter-řetězcové vazby.
• Deglykozylace in-line PNGase F umožnila odstranění heterogenity pro hladký masový profil intactního protilátkového agens.
• IdeS fragmentace a následná redukce odhalily detailní podíl na subjednotky a potvrdily shodu sekvencí u srovnávaných biosimilárních preparátů.
• Automatizace na Bravo zkrátila dobu přípravy vzorků z >1 dne manuálně na <6 h s vysokou reproducibilitou.

Přínosy a praktické využití metody

Metody umožňují ve farmaceutickém výzkumu a QA/QC:

• Rychlou kontrolu homogenity a integrity mAb v různých výrobních šaržích.
• Porovnání originálních a biosimilárních protilátek (mirror-plot dekonvoluce).
• Stanovení glykanového profilu, DAR pro ADC, identifikaci nechtěných modifikací.
• Široké použití v průmyslové analytice, akademickém výzkumu i regulovaných prostředích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace automatizace a škálovatelnosti pro 96 vzorků a více.
• Rozvoj mikroflow a nanoflow LC-MS pro zlepšení citlivosti.
• Native mass spectrometry pro zachování prostorové struktury intactních protilátek.
• Pokročilé techniky top-down analýzy pro vymezení místných post-translačních modifikací.
• Implementace ve vysokoprodukčních GMP laboratořích pro rutiní QC biologik.

Závěr

Komplexní workflow Agilent kombinuje reverzně-fázovou chromatografii, vysoce výkonné LC/Q-TOF systémy a automatizovanou platformu AssayMAP Bravo s inteligentním softwarem BioConfirm. Výsledkem je rychlá, spolehlivá a vysoce výkonná analýza intactních protilátek a jejich subjednotek s vynikající hmotnostní přesností a reproducibilitou.

Reference

• Intact Protein Analysis Using an Agilent 6550 Q-TOF Mass Spectrometer, Agilent Technologies, publ. 5991-2116EN.
• Analysis of Monoclonal Antibody Using Agilent 1290 Infinity LC System Coupled to Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF, Agilent Technologies, publ. 5991-4266EN.
• Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF, Agilent Technologies, publ. 5991-7813EN.
• An Integrated Workflow for Intact and Subunits of Monoclonal Antibody Accurate Mass Measurements, Agilent Technologies, publ. 5991-8445EN.
• An Integrated Workflow for Automated Calculation of Antibody-Drug Conjugate Drug-to-Antibody Ratio (DAR), Agilent Technologies, publ. 5991-7366EN.
• Beck A.; Wagner-Rousset E.; Anal. Chem. 2013, 85(2), 715–736.