CERM: CONSIDERATIONS FOR DEVELOPING A GREENER CHROMATOGRAPHIC METHOD

Význam tématu

Reverzní fázová kapalinová chromatografie (RPLC) je klíčová metoda pro separaci organických a biomolekulárních analytů. Tradičně využívá acetonitril a methanol, přičemž acetonitril je vysoce výkonný, ale toxický a označený jako třída 2. S rostoucím důrazem na udržitelnost je nutné vyvíjet zelenější chromatografické metody s nižší spotřebou toxických organických rozpouštědel.

Cíle a přehled studie

Studie se rozdělila do dvou částí:

• Study 1: Snížení spotřeby acetonitrilu prostřednictvím redukce vnitřního průměru a délky kolony při zachování poměru délky k průměru částice (L/dp).
• Study 2: Náhrada acetonitrilu za methanol (MeOH) či isopropylalkohol (IPA) při analýze intact mAb (NISTmAb) v LC–MS.

Použitá metodika a instrumentace

Study 1 – redukce rozpouštědla:

• Kolony: XBridge BEH C8 (4,6×150 mm, 5 µm), XBridge BEH C8 XP (3,0×75 mm, 2,5 µm), CORTECS UPLC C8 (2,1×50 mm, 1,6 µm).
• Detekce UV při 254 nm, teplota 30 °C, gradient acetonitril:voda:octová kyselina (45:54:1).
• Řízení průtoku a doby běhu skalované podle rozměrů kolony.

Study 2 – náhrada rozpouštědla:

• Systém BioAccord UPLC I-Class PLUS s detektorem RDa a TUV.
• Kolona BioResolve RP mAb Polyphenyl 2,1×50 mm, 2,7 µm, 450 Å, teplota 80 °C.
• Detekce UV při 280 nm, mobilní fáze A: voda + 0,1 % HCOOH, B: 95 % ACN/MeOH/IPA + 0,1 % HCOOH.
• Gradientní program s celkovou dobou běhu 7 minut.

Hlavní výsledky a diskuse

Study 1:

• Při přechodu z 4,6×150 mm na 3,0×75 mm kolony se acetonitril snížil čtyřnásobně.
• Další zmenšení na 2,1×50 mm vedlo k redukci spotřeby acetonitrilu až třináctkrát.

Study 2:

• Surové a dekonvoluované masové spektra NISTmAb naznačují, že IPA a acetonitril poskytují podobnou nebo lepší kvalitu signálu (17 % minimální údolí proti 20 % u methanolu).
• Při použití IPA rostl systémový tlak, ale zůstal pod maximem specifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Omezení spotřeby acetonitrilu přináší nejen finanční úsporu a snížení environmentální zátěže, ale i zachování analytické výkonnosti. Výběr vhodné kolony a alternativních rozpouštědel umožňuje udržitelnější provoz chromatografických laboratoří v oblasti farmacie a biotechnologií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj bude směřovat k:

• Dalšímu miniaturizování kolonn a využití sub2 µm a monolitických fází pro ultraefektivní separace.
• Rozšíření spektra ekologických nerozpustných mobilních fází, včetně vodou obohacených směsí a superkritické tekutiny.
• Integraci online metody hodnocení životního cyklu rozpouštědel a automatizované volby optimálního protokolu.

Závěr

Shrnuto: redukcí velikosti kolony lze dosáhnout výrazného snížení spotřeby acetonitrilu, přičemž isopropylalkohol představuje vhodnou a někdy i výkonnější alternativu k acetonitrilu pro LC–MS analýzu intact mAb. Tento přístup podporuje implementaci udržitelných chromatografických postupů bez kompromisů na kvalitě dat.

Reference

1. ACS GCI Pharmaceutical Roundtable Collaboration to Deliver a Solvent Selection Guide for the Pharmaceutical Industry. Pfizer Medicinal Chemistry Solvent Selection Guide, ACS Green Chemistry Institute.
2. Shion, H. et al. Enabling Routine and Reproducible Intact Analysis When Data Integrity Matters. Waters Application Note, 2019.
3. FDA Q3C – Tables and List Guidance for Industry, klasifikace rozpouštědel.
4. Li, J. Selection of Solvents and Mobile Phases for HPLC to Optimize Sensitivity of UV Detection, Analysis and Purification 2(1):72–75, 1987.
5. Li, J. Signal-to-Noise Optimization in HPLC UV Detection, LC-GC 10(11):856–864, 1992.
6. Snyder, L. Practical HPLC Method Development, 2nd ed., pp. 59–79, 722–726, 1997.