Automated Protein Modification Characterization of the Intact and Subunit NIST Monoclonal Antibody Reference Standard with Waters UNIFI Scientific Information System

Význam tématu

Charakterizace monoklonálních protilátek (mAb) na úrovni intaktního proteinu a jejich podjednotek je klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik. Vysokorozlišující LC–HRMS analýza umožňuje odhalit rozdíly v hmotnosti způsobené posttranslačními modifikacemi (PTM), které mohou ovlivnit farmakokinetiku a biologickou aktivitu léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ukázat plně automatizovaný workflow pro měření přesné hmotnosti a kvantifikaci modifikací intaktního mAb a jeho podjednotek pomocí systému Waters UNIFI řízeného hmotnostním spektrometrem Vion IMS QTof. Studijním vzorkem byl NIST mAb Referenční Standard RM 8671.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky intaktního mAb připraveny v 25 mM octanu amonném; pro analýzu podjednotek zpracovány enzymem IdeS a částečně redukovány DTT. Separace probíhala na ACQUITY UPLC H-Class Bio System s kolonkou BEH C4 při 80 °C.

• Hmotnostní spektrometr: Vion IMS QTof s detektorem QuanTof2
• Softwarové řízení a zpracování: UNIFI Scientific Information System 1.8.2
• Dekonvoluce: MaxEnt 1 s manuálním nebo „Tof“ modelem šířky špiček

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní mAb:

• Detekováno pět nejabundantnějších glykoform při hmotnostní odchylce <10 ppm
• Potvrzené PTM: N-terminální pyroglutamin (>99 %), C-terminální odštěpení lysinu (10,5 %) a glykace (14,6 %) po odstranění N-glykanů PNGase F

Podjednotky:

• Rozdělení na LC, Fdʼ a scFc subjekty s baseline resolution
• Glykoformy scFc odpovídají intaktní analýze; LC a Fdʼ vykazují rovněž glykaci
• Relativní kvantifikace modifikací založena na MS signálu každé podjednotky

Přínosy a praktické využití metody

Workflow v UNIFI výrazně snižuje potřebu manuálních zásahů při dekonvoluci a přiřazování špiček, poskytuje reprodukovatelné a validovatelné výsledky a urychluje analýzu v QC laboratořích a výzkumných centrech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení citlivosti a rychlosti detekce modifikací díky rozvoji IMS technologií a pokročilé automatizace zpracování dat. Integrace vícedimenzionálních analýz (RT, m/z, intenzita, IMS drift) přispěje k detailnější charakterizaci komplexních biologik.

Závěr

Představený end-to-end systém Vion IMS QTof/UNIFI nabízí robustní, automatizované řešení pro kvantitativní a kvalitativní charakterizaci intaktních mAb a jejich podjednotek. Kombinace vysokého rozlišení a workflow řízeného softwaru urychluje vývoj a kontrolu bioterapeutik.

Reference

1. Shion H., Yu Y.-Q. High-performance Vion IMS QTof for monoclonal antibody intact and subunit mass analysis; Waters Corporation, 720005906EN, 2017.
2. Fang J., Yu Y.-Q., Du M., Chen W. Peptide mapping with higher confidence using IMS QTof mass spectrometry; Waters Corporation, 720005905EN, 2017.