Towards a More Complete Glycome: Advances in Ion Chromatography-Mass Spectrometry (IC-MS) for Improved Separation and Analysis of Carbohydrates

Význam tématu

Glykomika se zaměřuje na studium komplexních sacharidových struktur v proteinech a dalších biomolekulách. Položka glykanů významně ovlivňuje funkci buněčných procesů, imunitní odpověď a interakce v biologických systémech. Vysoce účinné chromatografické metody spojené s hmotnostní spektrometrií bez nutnosti derivatizace poskytují podstatně detailnější pohled na rozmanitost a izomerii těchto struktur.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat novou kombinaci vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie HPAE s Orbitrap hmotnostním spektrometrem. Představen byl nový analytický sloupec Dionex CarboPac PA300 vhodný k současnému rozdělení neutrálních i nabitých glykanů. Studie zahrnovala analýzu uvolněných O-glykanů z prasečího mukinu i oligosacharidů z komerčního lactose–free mléka.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byl použit systém Thermo Scientific Dionex ICS-6000 HPIC s párovacími sloupci BorateTrap inline a novým analytickým sloupcem CarboPac PA300 (2×250 mm) s ochranou CarboPac guard. Průtok činil 0,25 mL/min a eluát byl veden jak do pulzní amperometrické detekce PAD, tak do hmotnostního spektrometru.

Hmotnostní spektrometrie byla prováděna na Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap v negativním režimu ESI, spektrální rozsah m/z 400–2000 při rozlišení 60000 a AGC cíli 3×106. Další fragmentační analýza využila závislou metodu Top10 a databázi UniCarb-DB pro interpretaci MS/MS spectrum.

Hlavní výsledky a diskuse

Nový sloupec CarboPac PA300 umožňuje lepší rozlišení neutrálních glykanů ve stejné analýze s nabitými formami bez derivatizace. V porovnání s PA200 se posunuly rané eluce neutrálních druhů a zlepšila se separace izomerů, zejména u isobarických a sulfátovaných oligosacharidů. Data ukázala schopnost identifikovat struktury s vysokou přesností m/z (chyba pod 5 ppm) a spolehlivě určit izomerii na základě eluačních časů a fragmentačního vzorce.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost analýzy přirozených glykanů bez chemické modifikace minimalizuje ztráty kyselých zbytků a zkreslení kompozice.
• Vysoké rozlišení HPAE odděluje isomerní glykanové druhy, čímž rozšiřuje škálu aplikací v glykoproteomice a potravinářském průmyslu.
• Workflow kombinující PAD a Orbitrap MS poskytuje doplňkové kvantitativní i kvalitativní informace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování výzkumu zahrnuje automatizaci přípravy vzorků, rozšíření portfolia sloupců pro specifické typy glycanu a integraci se statistikou velkých dat pro profilování glykomu. Rozvoj vysokopevnostních hmotnostních spektrometrů a datových knihoven povede k rychlejší a přesnější identifikaci nových glykanových struktur v klinických i průmyslových aplikacích.

Závěr

Kombinace HPAE-PAD/MS na nové kolonce CarboPac PA300 a Orbitrap hmotnostního spektrometru představuje výkonný nástroj pro komplexní charakterizaci glykanů. Metoda umožňuje spolehlivou separaci neutrálních, sialylovaných i sulfátovaných O-glykanů bez derivatizace, čímž zvyšuje kvalitu dat pro výzkum glykomiky.

Reference

• Analytical and Bioanalytical Chemistry 2017;409(12):3089–3101
• Molecular & Cellular Proteomics 2017;16(5):743–758