O-glycan profiling using HPAE-PAD hyphenated with a high-resolution accurate mass (HRAM) mass spectrometer

Význam tématu

Glykanová analýza posttranslačních modifikací proteinů, zejména O-glykosylace, je klíčová pro pochopení biologických procesů a diagnostiku nemocí souvisejících s abnormální glykosylací. Techniky umožňující vysoké rozlišení separace a přesnou identifikaci O-glykanů přispívají k detailní strukturní charakterizaci a zpřesňují interpretaci patologických změn.

Cíle a přehled studie

Autoři představují workflow kombinující reduktivní β-eliminaci, čistící krok na grafitovaném uhlíkovém sorbentu a následnou analýzu uvolněných O-glykanů pomocí HPAE-PAD spojené s vysokorozlišujícím Orbitrap MS. Metoda byla aplikována na čtyři modelové glykoproteiny: mucin typu III (prasátko), fetuin, fibrinogen a thyroglobulin (býkovci).

Použitá metodika a instrumentace

Uvolnění O-glykanů:

• Reduktivní β-eliminace (1 M NaOH, NaBH4, 50 °C, 16 h)
• Neutralizace formiátovou kyselinou, vakuové sušení
• Čištění na HyperSep Hypercarb SPE

Separace a detekce:

• HPAE-PAD: Dionex ICS-5000+ se CarboPac PA300-4 µm kolony
• Post-column desalter: Dionex ERD 500
• Pulsed amperometric detection (TN21)
• MS: Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap, HESI-II, negative ESI, HCD MS2
• Software: Chromeleon 7.2.9, Xcalibur 4.1.31.9, SimGlycan 5.0

Hlavní výsledky a diskuse

U mucinu typu III byl detekován komplexní soubor neutrálních, sialylovaných i sulfátovaných O-glykanů s vysokou rozlišovací silou a hmotnostní přesností (<5 ppm). Ve fetuinu převládaly tri- a tetrasacharidové O-glykany na typu 1 jádru s terminálními Neu5Ac/Neu5Gc; identifikovány byly též N-glykany. U fibrinogenu se potvrdily mono-/di-/trisialylované O-glykany s Neu5Ac/Neu5Gc. U bovinního thyroglobulinu byl poprvé experimentálně prokázán jeden O-glykan ([Neu5Ac][Hex][HexNAc]). Všechny struktury byly podpořeny diagnostickými fragmenty v MS2 spektru.

Přínosy a praktické využití metody

• Label-free workflow bez derivatizace
• Vysoce selektivní separace neutrálních i nabitých glykanů
• Současná detekce PAD a MS umožňuje komplementární informace
• Vysoká přesnost m/z a bohaté MS2 fragmenty podporují důvěryhodné přiřazení

Budoucí trendy a možnosti využití

Cílem dalšího vývoje je zkrácení doby přípravy, integrace automatizované desaturace a rozšíření aplikace na komplexní biologické vzorky (tj. plazma, buněčné lyzáty). Přínosné může být také nasazení ion mobility pro lepší rozlišení izomerů a vývoj softwarových nástrojů pro automatizaci strukturní annotace.

Závěr

Popsaný HPAE-PAD/MS workflow pro O-glykanovou analýzu nabízí robustní, citlivý a vysoce specifický přístup k profilování a strukturnímu určování O-glykanů z různých glykoproteinů. Metoda prokázala univerzální využitelnost, vysokou spolehlivost a potenciál pro další rozšíření v glykoproteomice.

Reference

1. Reily C. et al. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2019, 15:346–366.
2. Montpetit M.L. et al. Regulated and aberrant glycosylation modulate cardiac electrical signaling. PNAS. 2009, 106:16517–16522.
3. Hanisch F.G. O-glycosylation of the mucin type. Biol Chem. 2001, 382:143–149.
4. Budnik B.A. et al. Global methods for protein glycosylation analysis by mass spectrometry. Biochim Biophys Acta. 2006, 1764(12):1870–1880.
5. Bennett E.P. et al. Control of mucin-type O-glycosylation: classification of the GalNAc-transferase family. Glycobiology. 2012, 22:736–756.
6. Szabo Z. et al. In-depth analyses of native N-linked glycans by HPAE-PAD-MS. Anal Bioanal Chem. 2017, 409(12):3089–3101.
7. Thermo Fisher Scientific. AN73063: Improved profiling of sialylated N-linked glycans by IC-Orbitrap MS. 2020.
8. Thermo Fisher Scientific. TN72478: Instrument configuration for HPAE-PAD/MS. 2020.
9. Thermo Fisher Scientific. TN21: Optimal settings for pulsed amperometric detection. 2020.
10. Thermo Fisher Scientific. TN71: Eluent preparation for HPAE-PAD. 2020.
11. Thermo Fisher Scientific. AN74042: Structural characterization of mucin O-linked glycans. 2021.
12. Bergstrom K.S., Xia L. Mucin-type O-glycans and their roles in intestinal homeostasis. Glycobiology. 2013, 23(9):1026–1037.
13. Carr S.A. et al. Selective identification of N- and O-linked oligosaccharides by LC-MS. Protein Sci. 1993, 2(2):183–196.
14. Lin Y.H. et al. In-depth analysis of proteoforms of serum and fetuin. J Proteome Res. 2018, 17(8):2861–2869.
15. Edge A.S., Spiro R.G. Presence of O-glycosidic hexasaccharide in fetuin. J Biol Chem. 1987, 262(33):16135–16141.
16. Zauner G. et al. Protein glycosylation analysis by HILIC-LC-MS. J Sep Sci. 2010, 33:903–910.
17. Zauner G. et al. Glycoproteomic analysis of human fibrinogen O-glycosylation. J Proteome Res. 2012, 11(12):5804–5814.
18. Ronin C. et al. Regulation of thyroglobulin glycosylation. J Biol Chem. 1986, 261(16):7287–7293.
19. Spiro M.J. Glucuronic acid-containing unit in human thyroglobulin. J Biol Chem. 1977, 252(15):5424–5430.