Elucidating the Complexities of the Human Milk Glycomewith Ion Chromatography-Mass Spectrometry (IC-MS)

Význam tématu

Zkoumání glykánu obsažených v lidském mléce je zásadní pro pochopení jejich biologických funkcí v imunitě, výživě a mikrobiálním ekosystému střev. Vývoj citlivých a účinných analytických metod umožňuje odhalit strukturální rozmanitost těchto komplexních sacharidů bez nutnosti chemické derivatizace, což přispívá k rychlejší a komplexnější charakterizaci glykomu mléka.

Cíle a přehled studie

Studie představuje novou workflow založenou na kombinaci iontové chromatografie s pulzní amperometrií (PAD) a vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií Orbitrap (IC-MS). Hlavním cílem bylo derivatizaci nevyžadující oddělení a identifikace volných oligosacharidů (HMOs) a N- i O-vázaných glykánů z lidského mléka, včetně detekce strukturálních izomer.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorků zahrnoval:

• Odstranění bílkovin a volných oligosacharidů studenou precipitací ethanolem.
• Enzymatické uvolnění N-glykánů pomocí PNGase F.
• Beta-eliminace pro uvolnění O-glykánů.
• Čištění vzorků na HyperSep Hypercarb filtrech.

Analytické oddělení a detekce probíhaly na systému Thermo Scientific Dionex ICS-6000 HPIC spojeném s PAD a Q Exactive HF-X Orbitrap MS. Chromatografická kolona CarboPac PA300–4µm zajišťovala vysoké rozlišení heterogenních glykánů, následně byl proud eluentu odsolován v desalteru ERD 500 a přiveden do MS s HESI-II zdrojem v negativním módu ionizace.

Použitá instrumentace

• Dionex ICS-6000 HPIC system
• CarboPac PA300–4µm kolona
• Pulsní amperometrický detektor (PAD) s PdH elektrochemickou buňkou
• Desalter Dionex ERD 500
• Thermo Scientific Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
• Heated ESI-II ionizační zdroj

Hlavní výsledky a diskuse

Nová konfigurační uspořádání PAD a MS v sérii umožnila detekovat celkem 102 unikátních glykánových struktur v lidském mléce, včetně volných HMO, N-glykánů a šesti O-glykánů. Mezi identifikovanými glykány byly neutrální, fukosylované i sialylované formy a četné strukturální izomery. Chromatografické oddělení odhalilo různé vzorce eluce – volné HMO se objevily v první části běhu, N-glykány následovaly s trendem od neutrálních k sialylovaným strukturám. Diagnostické fragmenty v MS2 umožnily rozlišení izomerů, například Lacto-N-neotetraosy a jejích neotetraosových izomerů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí derivatizaci nevyžadující, vysoce citlivou analýzu glykanů s vynikajícím chromatografickým rozlišením a hmotnostní přesností. Umožňuje komplexní charakterizaci širokého spektra glykanů v jediné analýze a odhaluje důležité strukturální izomery, což je klíčové pro biomedicínský výzkum, farmaceutické aplikace a kontrolu kvality mléčných výrobků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zlepšení throughputu a automatizace přípravy vzorku.
• Propojení s kvantitativními metodami pro sledování změn glykopatternu v různých fázích laktace.
• Integrace s bioinformatickými nástroji pro hlubší interpretaci biologických funkcí glykánů.

Závěr

Prezentovaná hyfenace iontové chromatografie s pulzní amperometrií a vysokorozlišovací MS umožňuje detailní mapování lidského mléčného glykomu bez potřeby chemické derivatizace. Metoda prokázala schopnost odhalit vysokou diverzitu glykánových struktur včetně izomerů a poskytuje robustní platformu pro další glykomické studie.

Reference

1. Porfirio S. et al. New strategies for profiling and characterization of human milk oligosaccharides. Glycobiology. 30(10):774-786 (2020).
2. Lu Y. et al. Mass spectrometry analysis of changes in human milk N/O-glycopatterns at different lactation stages. J. Agric. Food Chem. 67(38):10702-10712 (2019).
3. Ceroni A. et al. GlycoWorkbench: computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. J. Proteome Res. 7:1650-1659 (2008).
4. Domon B., Costello C.E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconj. J. 5:397-409 (1988).