Simple and sensitive quantitation of large therapeutic proteins in plasma in 90 minutes

Význam tématu

Analytická kvantifikace velkých terapeutických proteinů, jako jsou monoklonální protilátky, v krevní plazmě je klíčová pro hodnocení farmakokinetiky, účinnosti a bezpečnosti bioterapeutik. Tradiční enzymatické digesce trypsinem bývá zdlouhavá (3–24 hodin) a proměnná, což omezuje citlivost, reprodukovatelnost a efektivitu laboratorních postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je popsat rychlou, jednoduchou a citlivou metodu pro kvantifikaci lidské IgG v myší plazmě pomocí Thermo Scientific SMART Digest™ Soluble kitů s celkovou dobou přípravy vzorku 90 minut. Metoda porovnává výkon tepelně aktivovaného termofilního trypsinu se standardními digesčními postupy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly použity:

• Myší plazma modifikovaná lidskou IgG v koncentracích 0,5–500 μg/mL (kalibrace) a QC vzorky při 0,5, 5, 50 a 500 μg/mL.
• Thermo Scientific SMART Digest Soluble Trypsin Kit se zapojením 5 μL enzymu na 350 μg proteinů a jednorázovým zahříváním 90 minut při 70 °C.
• Neutralizace octanovou kyselinou (1 % TFA) a přímá injekce 4 μL na LC-MS/MS.

Instrumentace:

• UHPLC: Thermo Scientific UltiMate 3000 Rapid Separation Dual system s Accucore C18 kolonkou (2,1×50 mm, 2,6 μm).
• MS: Thermo Scientific Velos Pro iontový pastový hmotnostní spektrometr s HESI zdrojem v pozitivním módu, detekce přechodů m/z 603,4→805,4 a 937,7→836,5.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsahy pro peptidy VVSVLTVLHQDWLNGK (m/z 603,4) a TTPPVLDSDGSFFLYSK (m/z 937,7) dosáhly koeficientů R² přes 0,9997. Variabilita (CV) při LLOQ (0,5 μg/mL) byla 9,9 % (peptid 603,4) a 11,6 % (peptid 937,7), při ULOQ (500 μg/mL) 4,7 % a 3,8 %. Tepelně asistovaná digesce vedla k desetinásobnému zvýšení citlivosti a výraznému zkrácení doby přípravy.

Přínosy a praktické využití metody

Nová metoda nabízí:

• Rychlou jednorázovou enzymatickou digesci bez přídavných denaturačních činidel.
• Reprodukovatelné a citlivé stanovení rozsahu 0,5–500 μg/mL v plazmě.
• Snížení nákladů na enzym a zkrácení pracovního toku z 24 hodin na 1,5 hodiny.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření použití tepelně stabilních enzymů na další biopolymery, plná automatizace v 96-jamkových formátech a integrace s vysokoprůtokovými platformami. Další vývoj může směřovat k optimalizaci multiplexních kvantifikací a nasazení v klinických studiích a průmyslové QA/QC.

Závěr

Tepelně asistovaná digesce pomocí SMART Digest Soluble kitů umožňuje rychlé, citlivé a ekonomické stanovení velkých terapeutických proteinů v plazmě s vysokou reprodukovatelností a lineárními kalibracemi až do 500 μg/mL během 90 minut.

Reference

1. Becker J.O. a Hoofnagle A. Replacing Immunoassays with Tryptic Digestion-Peptide Immunoaffinity Enrichment and LC-MS/MS. Bioanalysis. 2012, 4(3), 281–290.
2. Keil-Dlouha V. et al. Proteolytic Activity of Pseudotrypsin. FEBS Letters. 1971, 16(4), 291–295.
3. van den Broek I. et al. Evaluation of Interspecimen Trypsin Digestion Efficiency Prior to Multiple Reaction Monitoring-Based Absolute Protein Quantification with Native Protein Calibrators. J. Proteome Res. 2013, 12, 5760–5774.
4. Thermo Fisher Scientific. SMART Digest Peptide Mapping and Quantitation Compendium, 2018.