LC-MS Bioanalytical Quantification of a GalNAc-siRNA Conjugate Oligonucleotide Using Semi-Automated Solid Phase Extraction

Význam tématu

S narůstajícím zájmem o oligonukleotidové terapie roste potřeba citlivých a reprodukovatelných analytických metod pro kvantifikaci těchto látek v biologických vzorcích. GalNAc-siRNA konjugáty jsou náchylné k adsorpci na kovové povrchy i proteiny, což komplikuje extrakci a chromatografickou analýzu. Poloautomatizace přípravy vzorku sníží variabilitu a ztráty analytu.

Cíle studie

Hlavním cílem bylo vyvinout poloautomatizovanou metodu pro extrakci GalNAc-siRNA z plazmy a moče pomocí pozitivně tlakového SPE a následnou kvantifikaci pomocí LC-MS/MS. Metoda měla dosahovat nízkých mezí detekce, vysokých procentních výtěžků a minimálních matricových vlivů.

Použitá metodika

Metoda zahrnovala:

• Přípravu pracovní a kalibrační řady s interním standardem Gem132
• SPE na Oasis WAX muElution destičkách řízené přístrojem Otto SPEcialist pod pozitivním tlakem
• Chromatografii na ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 kolonu se specifickým HFIP/DIPEA mobilním fázemi
• Detekci a kvantifikaci na Xevo TQ-XS hmotnospektrometru v režimu MRM

Extrahované vzorky se analyzovaly injekcí 10 µl a rychlým gradientem při teplotách kolony 50 °C a autosampleru 8 °C.

Použitá instrumentace

• Pipette+ s OneLab software pro automatizované pipetovací kroky
• Otto SPEcialist Positive Pressure Manifold pro řízenou extrakci SPE
• ACQUITY Premier LC System
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 Column s MaxPeak HPS povrchem
• Xevo TQ-XS Triple Quadrupole Mass Spectrometer
• Softwary MassLynx v4.2 a TargetLynx pro řízení a kvantifikaci dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla:

• Výtěžků SPE ve zpětném rozpětí 88–110 % se statistickou odchylkou pod 10 %
• Lineárního rozsahu 2–1000 ng/ml pro plazmu a 5–1000 ng/ml pro moč
• Mezí detekce 1 ng/ml ve vyčištěných extraktech
• Regulační přesnosti a reprodukovatelnosti v rámci ±20 %

MaxPeak HPS technologie minimalizovala nežádoucí kovovou adsorpci oligonukleotidů a zajistila stabilní chromatografické podmínky.

Přínosy a praktické využití metody

Poloautomatizace snižuje mezioperátorovou variabilitu a chybovost manuální přípravy vzorků. Metoda umožňuje robustní bioanalytické vyhodnocení terapeutických oligonukleotidů a snadnou přenositelnost protokolu mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření na jiné typy konjugovaných oligonukleotidů a biopolymerů
• Integrace plně automatizovaných pracovních stanic pro vyšší throughput
• Optimalizace mobilních fází a kolonní technologie pro ještě vyšší citlivost a rychlost analýzy
• Využití umělé inteligence pro analýzu a predikci výkonu metody

Závěr

Vyvinutá poloautomatizovaná metoda SPE a LC-MS/MS pro GalNAc-siRNA konjugát dosahuje vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a robustnosti. Spojení inovativní povrchové úpravy kolony a kontrolované extrakce přináší spolehlivý nástroj pro bioanalytické kvantifikace v preklinickém i klinickém prostředí.

Reference

• Chapter 5 Automation Tools and Strategies for Bioanalysis Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis Elsevier 2003
• Brennan K Improved Oligonucleotide SPE-LC-MS Analysis Using MaxPeak High Performance Technology Waters Application Note 720007019EN 2020
• Bansal S DeStefano A Key Elements of Bioanalytical Method Validation for Small Molecules The AAPS Journal 2007 9 1 E109–E114