Quality control of oligonucleotides with a single quadrupole mass spectrometer

Význam tématu

Kvalita oligonukleotidů je kritická v biotechnologii, vývoji genových terapií a farmaceutickém výzkumu. Spolehlivá kontrola identity a čistoty těchto makromolekul zajišťuje bezpečnost, účinnost a reprodukovatelnost výsledků. Kombinace chromatografie s hmotnostní spektrometrií přináší rychlý, robustní a přesný přístup vhodný pro rutinní analýzu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat využití jednočtvercového kvadrupolového hmotnostního spektrometru ISQ EM spojeného s UHPLC Vanquish Flex pro kontrolu kvality 52 nukleotidů dlouhého jednořetězcového DNA analyzovaného ve vodném roztoku 10 µM. Představeny byly dva datové workflow: přímé potvrzení identity podle nejintenzivnějších m/z signálů a alternativní přístup založený na dekonvoluci celého spektrem pro stanovení přesné molekulové hmotnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie:

• UHPLC Vanquish Flex Binary s Hypersil GOLD™ 2,1×50 mm, 1,9 µm
• Gradientní eluční metoda s mobilními fázemi A (voda+0,1 % TEA+2 % HFIP) a B (methanol+0,1 % TEA+2 % HFIP)
• Průtok 0,4 mL·min⁻¹, teplota kolony 40 °C

Hmotová spektrometrie:

• ISQ EM, HESI zdroj v negativní polaritě
• Vaporizer 300 °C, přenosová trubice 350 °C, napětí -3 000 V
• Rozsah m/z 600–2 000, doba skenu 0,5 s
• Analýza v Chromeleon CDS s rezolucí profilu a integrovaným engine pro dekonvoluci

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace zdroje vedla k 2–3násobnému zvýšení signálu a výraznému snížení HFIP aduktů. Opakovatelné čtyřnásobné injekce vykázaly RSD retenčního času <0,05 % a plochy píku <4 % u UV i MS detekce. Spektrální analýza odhalila deprotonované náboje z 12+ až 18+, s nejintenzivnější nabitostí 16+ (m/z 1 016,41). Dekonvoluce ukázala hlavní hmotnost analyzovaného oligonukleotidu (16 280,19 Da) s odchylkou 1,59 Da a jeho HFIP adukt (16 447,99 Da) s 1,39 Da.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a přesné potvrzení identity i čistoty oligonukleotidů v jediném běhu. Plná integrace s Chromeleon CDS zjednodušuje zpracování dat a přináší automatizované reporty. Spojení UV a MS detekce minimalizuje zkreslení purity vlivem spoluelujících nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití dekonvolučních algoritmů pro složitější sekvence a delší oligonukleotidy, nasazení umělé inteligence pro automatickou optimalizaci parametrů a vyšší propustnost v online produkčních linkách. Dalším krokem může být kombinace s iontově mobilní spektrometrií pro detailní rozlišení izobarických aduktů.

Závěr

Ukázalo se, že jednočtvercový kvadrupolový hmotnostní spektrometr ISQ EM ve spojení s vanquish flex UHPLC a Chromeleon CDS poskytuje robustní, přesný a uživatelsky přívětivý postup pro identifikaci a kvantifikaci oligonukleotidů. Obě pracovní postupy – potvrzení podle m/z signálů i dekonvoluce – umožňují flexibilní přístup k analýze podle dostupných informací.

Reference

1. Thermo Scientific Application Note 72820. Oligonucleotide characterization for quality control and increased productivity by single quadrupole mass spectrometer with extended mass range.
2. Thermo Scientific Application Note 72976. Identity confirmation and accurate quantitation of a genotoxic impurity in an active pharmaceutical ingredient by UHPLC-UV coupled to a single quadrupole mass detector.