High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control

Význam tématu

Laboratoře syntetizující přizpůsobené oligonukleotidy potřebují efektivní kontrolu kvality s vysokou propustností a nízkými náklady. Metoda intaktní hmotnostní analýzy umožňuje rychlé ověření správné délky a čistoty sekvencí s minimem přípravy a spotřeby nákladných činidel.

Cíle a přehled studie

Cílem je představit kompletní workflow pro kontrolu kvality syntetizovaných oligonukleotidů (10–60 merů) využívající RP-HPLC s DNAPac RP kolónou a integrovanou jednou kvadrupólovou hmotnostní detekci. Studie zahrnuje optimalizaci chromatografických a zdrojových parametrů a automatizovanou dekonvoluci v Chromeleon CDS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky ve 96 jímkových deskách byly injektovány přímo bez čistění. Pro separaci byla použita Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s DNAPac RP 2.1×50 mm 4 μm kolónou při 70 °C, gradient s HFIP/TEA ve vodě a metanolu, průtok 0.7 ml/min, detekce UV při 260 nm. Hmotnostní spektrometr ISQ EM s HESI zdrojem v negativním módu pracoval v rozmezí 600–2000 m/z s optimalizovanými podmínkami:

• Vaporizér a přenosová trubice: 350 °C
• Sheath gas/auxiliary gas: 75 psig/7,5 psig
• Spray voltage: –3000 V
• Rozlišení a rychlost skenu: 0,5 s na spektrum

Data byla analyzována v Chromeleon 7.3 CDS pomocí IPD dekonvolučního enginu (ReSpect, rozsah 2000–20000 Da, izotopický model).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace HFIP koncentrace ukázala, že 0.1 % poskytuje nejlepší citlivost a nejnižší míru aduktů, což představuje 20-násobnou úsporu činidla oproti běžným 2 %. Workflow umožnil jednoznačnou detekci správných mas a identifikaci neúspěšných syntéz (např. chybějící 10 mer). Dekonvoluované spektra přinášejí spolehlivé potvrzení intaktní hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a automatizovaná kontrola kvality až 192 vzorků denně
• Minimální příprava vzorků bez nutnosti čištění
• Výrazné snížení spotřeby HFIP a eliminace sodných aduktů
• Jednoduché reportování pass/fail v Chromeleon CDS

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření zahrnuje integraci s vysokootáčkovými MS systémy, adaptaci pro modifikované oligonukleotidy, optimalizaci parametrů pro širší hmotnostní rozsahy a využití strojového učení pro pokročilou analýzu spekter.

Závěr

Popsaný postup představuje robustní, rychlý a nákladově efektivní řešení pro kvalitativní a kvantitativní kontrolu oligonukleotidů, které lze snadno automatizovat a integrovat do existujících laboratoří.

Reference

Köhler D., De Pra M. High throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control. Thermo Fisher Scientific 2022.