High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá analýza oligonukleotidů je klíčová pro kontrolu kvality syntézy DNA v biotechnologii, farmaceutickém výzkumu a výrobě genových terapií. Intaktní hmotnostní stanovení umožňuje jednoznačně potvrdit správnost délky a složení řetězců, identifikovat neúplné produkty a zlepšit efektivitu výrobních procesů při zachování vysoké propustnosti i přes rozsáhlé množství vzorků.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vytvořit robustní high-throughput workflow pro analýzu oligonukleotidů o délce 10–60 nukleotidů pomocí jednotného kvadrupólového hmotnostního spektrometru (ISQ EM) spojeného s UHPLC Vanquish Flex. Studie demonstruje optimalizaci chromatografických podmínek, parametry zdroje MS a automatické vyhodnocení intaktní hmotnosti s uživatelsky přívětivým reportem typu pass/fail.

Použitá metodika

Vzorky z DNA syntetizátoru byly vyhodnoceny bez dodatečné purifikace. Chromatografie probíhala na DNAPac RP kolóně (2,1×50 mm, 4 µm) v UHPLC systému Vanquish Flex s ion-pairing mobilní fází obsahující 0,1 % HFIP a trimethylammoniumacetát. Optimalizace HFIP se pohybovala v rozmezí 0,01–2 %, přičemž 0,1 % poskytlo nejlepší poměr intenzity signálu vůči množství aduktů.

Použitá instrumentace

Jako detekce sloužil Thermo Scientific ISQ EM Single Quadrupole Mass Spectrometer integrován v Chromeleon CDS 7.3 s modulem Intact Protein Deconvolution přizpůsobeným pro oligonukleotidy. Klíčová nastavení zdroje zahrnovala:

• Vaporizer a přenosová teplota: 350 °C
• Sheath/auxiliary plyn: 75/7,5 psig
• Spray voltage: -3000 V
• MS rozsah: 600–2000 m/z, negativní režim, doba scanu 0,5 s

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaná koncentrace 0,1 % HFIP snížila tvorbu HFIP aduktů a zvýšila intenzitu nejabundantnějšího náboje až o 20násobek oproti standardním 2 %. Workflow umožnilo chromatografické oddělení cílových oligonukleotidů od zbytků reaktantů bez nutnosti další purifikace. Deconvoluční parametry (ReSpect™, rozsah 2000–20000 Da, tolerance 100 ppm, výstup isotopický profil) vedly k automatizovanému porovnání naměřené hmotnosti s očekávanou a generování přehledného reportu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení propustnosti analýz až na stovky vzorků denně bez manuálních kroků.
• Výrazná úspora HFIP na úrovni až 95 % nákladů.
• Jednoduché ověření identity produktu v Chromeleonu s pass/fail výstupem.
• Možnost přizpůsobení dekonvolučních parametrů pro různé rozsahy hmotností.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšiřování kapacity high-throughput systémů, integrace s automatizovanými syntetizátory a rozšíření dekonvolučních nástrojů pro modifikované nukleotidy. Vývoj v oblasti ionizačních zdrojů a pokročilých datových analýz by mohl zvýšit selektivitu a citlivost měření, zejména pro terapeutické oligonukleotidy a vakcíny.

Závěr

Prezentovaný protokol nabízí kompletní řešení pro kvalitativní a kvantitativní kontrolu syntézy oligonukleotidů na bázi UHPLC–MS s vysokou přesností a propustností. Optimalizace HFIP a MS parametrů zajišťují minimální tvorbu aduktů, úsporu nákladů a snadnou automatizovanou validaci výsledků.

Reference

1. D. Köhler, M. De Pra, High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control, Thermo Fisher Scientific, 2022