Improving high-throughput Top-Down proteomics using a modified hybrid quadrupole-ultra-high-field-Orbitrap mass spectrometer

Význam tématu

Top-down proteomika umožňuje přímou analýzu intactních proteinů a jejich proteoform, čímž se zlepšuje charakterizace posttranslačních modifikací a variant. Tento přístup je klíčový v lékařském, farmaceutickém a biotechnologickém výzkumu, kde je nezbytné dosáhnout vysoké citlivosti, rozlišení a průchodnosti analýzy složitých biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje modifikaci orbitrapového spektrometru Q Exactive HF-X a implementaci pokročilých DDA algoritmů pro high-throughput top-down proteomiku. Porovnávají se režimy „Medium-High“ a „High-High“ akvizice na standardní trojici modelových proteinů, extraktu z E. coli a lidských 40S a 60S ribozomálních proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

• Režimy DDA: „Medium-High“ (rozlišení 7 500 při m/z 200, transient 16 ms) a „High-High“ (rozlišení 120 000 při m/z 200, transient 256 ms).
• UHPLC: Thermo Vanquish Horizon s kolonkou MabPac-RP 2.1 × 100 mm, 4 µm, gradient 15 min.
• Spektrometrie: upravený Thermo Scientific Q Exactive HF-X se zvýšenou kapacitou iontového trychtýře (HCTT), elektrodynamickým iontovým trychtýřem a vylepšenými algoritmy pro přiřazení nábojového stavu a on-the-fly dekonvoluci.
• Fragmentace: HCD s optimalizovanou energií pro každý vybraný proteoform.
• Software: Thermo BioPharma Finder 2.0, Proteome Discoverer 2.1 s nodem ProSight PD.

Hlavní výsledky a diskuse

• Redukce redundantní fragmentace až o 50 % a nárůst identifikovaných proteoform o 35 % oproti standardnímu Q Exactive HF.
• 3× lepší signál-šum (S/N) pro intactní proteiny (např. Carbonic Anhydrase II) při 16 ms vs. 32 ms transientech.
• Modelové proteiny (ubiquitin, myoglobin, carbonic anhydrase II) jednoznačně identifikovány za méně než 3 s při direct infusion.
• U E. coli ribozomálních proteinů identifikováno 67 ze 67 očekávaných subunit; u lidských 40S 32 ze 33 a 60S 45 ze 47 subunit.
• Pokročilé DDA algoritmy cíleně vybírají pouze nejintenzivnější nábojový stav proteoformy a vylučují opakované fragmentace, čímž se zvyšuje dynamický rozsah a hloubka pokrytí vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda umožňuje vysoce průchodné analýzy intactních proteinů s vysokým rozlišením a přesností hmotnostního měření. Je vhodná pro detailní proteoformní charakterizaci v biomedicínském výzkumu, kontrolu kvality biotechnologických produktů a studium posttranslačních modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace iontové mobility, strojového učení pro DDA strategie a rychlejších detektorů slibuje další zvýšení selektivity a prozkoumání složitých biologických matic v reálném čase. Kombinace top-down proteomiky s obrazováním molekulárních struktur otevře nové cesty v klinické diagnostice a personalizované medicíně.

Závěr

Modifikace Q Exactive HF-X a implementace inteligentního DDA workflow výrazně posouvají hranice high-throughput top-down proteomiky. Díky selektivnější fragmentaci a efektivnějšímu zpracování dat lze rychle a spolehlivě identifikovat proteoformy ve složitých biologických vzorcích.