Multiple ion activations and proton transfer charge reduction facilitate the characterization of capsid proteoforms of recombinant adeno-associated virus 6 (rAAV6)

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) se staly klíčovými genovými vektory v medicíně díky své nízké patogenitě a schopnosti efektivně doručit terapeutický genetický materiál. Detailní molekulární charakterizace kapcidálních proteinů VP1, VP2 a VP3 je zásadní pro kontrolu kvality, zajištění stability a optimalizaci funkčnosti těchto vektorů při klinických aplikacích genové terapie.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na charakterizaci proteoform subjednotek kapsidu rAAV6, serotypu využitelného pro epitelové a respirační buňky. Hlavním cílem bylo zvýšit sekvenační pokrytí jednotlivých subjednotek pomocí kombinace komplementárních fragmentačních technik (HCD, ETD/EThcD) a proton transfer charge reduction (PTCR) v multi-stupňové MSn analýze. Autoři optimalizovali podmínky pro jednotlivé subjednotky a vyhodnotili synergii MS2 a MS3 experimentů.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: rAAV6 exprimovaný v HEK293, purifikace spin-kolonkami (100 kDa) a denaturace 10 % kyselinou octovou.
• LC separace: Ultimate 3000™ UHPLC s BEH C4 kolonkou (100 mm×1 mm), eluce lineárním gradientem vody/ACN s 0,1 % DFA, průtok 100 µl/min.
• MSn analýza: Orbitrap Eclipse™ Tribrid MS, rozlišení 240 000 (m/z 200) v módu full profile.
• MS2 fragmentace: HCD (40–45 % NCE) a ETD/EThcD (10–20 ms).
• MS3 PTCR: perfluoroperhydrophenanthrenová aniontová reagens (C14F24), doba reakce 5–40 ms, izolace 1800 m/z v LTQ.
• Cílená izolace 12–15 nábojových stavů (160–210 m/z šířka) pro VP1, VP2 a VP3.

Hlavní výsledky a diskuse

• VP1 (81 kDa): kombinace HCD MS2 a ETD MS2 zvýšila sekvenační pokrytí na ~20 %.
• VP2 (67 kDa): optimalizace HCD/ETD vedla k nárůstu pokrytí z ~9,5 % na ~16 %.
• VP3 (59 kDa): díky vysoké abundanci umožnilo spojení ETD MS2–PTCR MS3 s HCD dosáhnout ~38 % pokrytí, především detekcí větších fragmentů po redukci náboje.
• PTCR výrazně redukovalo překryv signálů ve spektru a zlepšilo kvalitu dat pro vysoce nabité ionty.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší sekvenační pokrytí umožňuje spolehlivou identifikaci proteoform a jejich modifikací v AAV kapsidu.
• Metodika poskytuje robustní nástroj pro rutinní QC genových vektorů.
• PTCR rozšiřuje možnosti analýzy intact proteinů v komplexních biologických vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace HILIC a dalších separačních technik pro zdokonalení oddělení VP1 a VP2.
• Další optimalizace PTCR parametrů pro analýzu nízkoabundantních proteinů.
• Automatizace workflow LC–MSn pro standardizovanou kontrolu kvality AAV výrobků.

Závěr

Kombinace komplementárních MS2 fragmentačních režimů a MS3 PTCR je klíčová pro komplexní charakterizaci rAAV6 kapsidálních proteoform. Navržený postup podporuje vývoj standardizovaných QC metod a přispívá k vyšší bezpečnosti a účinnosti genové terapie.

Reference

1. Herron W. J.; Goeringer D. E.; McLuckey S. A. Gas-Phase Electron Transfer Reactions from Multiply-Charged Anions to Rare Gas Cations. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117(46), 11555–11562.
2. Kline J. T.; Mullen C.; Durbin K. R.; Oates R. N.; Huguet R.; Syka J. E. P.; Fornelli L. Sequential Ion–Ion Reactions for Enhanced Gas-Phase Sequencing of Large Intact Proteins in a Tribrid Orbitrap Mass Spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021.
3. Liu A. P.; Patel S. K.; Xing T.; Yan Y.; Wang S.; Li N. Characterization of Adeno-Associated Virus Capsid Proteins Using Hydrophilic Interaction Chromatography Coupled with Mass Spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 2020, 189, 113481.