Highly sensitive intact mass analysis of AAV capsid proteins using a UHPLC-FLD- HRAM MS platform

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) představují jedno z nejefektivnějších a nejbezpečnějších řešení pro cílenou genovou terapii. Charakterizace jejich kapsidových proteinů VP1, VP2 a VP3 je zásadní pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti virových vektorů.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikované studie bylo ukázat schopnosti platformy UHPLC-FLD-HRAM MS spojené s Orbitrap Exploris 480 pro:

• Citlivou a přesnou analýzu intaktní hmotnosti AAV kapsidových proteinů.
• Rychlé stanovení poměru VP1 : VP2 : VP3 pomocí fluorescence.
• Top-down potvrzení sekvence a identifikaci nízkomolekulárních proteoform.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek AAV6 byl exprimován v buňkách HEK293, po purifikaci pufrován do 80 % H₂O/20 % acetonitril s 5 mM TCEP a 0,1 % FA. Chromatografie probíhala na C4 kolóně (1 × 100 mm, 300 Å, 1,7 µm) při 80 °C na systému Vanquish Horizon UHPLC. Fluorescenční detekce byla nastavena na excitaci 280 nm a emisi 350 nm. Analýza MS a MS² byla provedena na Orbitrap Exploris 480 s BioPharma Option.

• UHPLC Vanquish Horizon/Flex (systémová báze, pumpy, sampler, komora)
• Vanquish Fluorescence Detector s micro flow buňkou
• Orbitrap Exploris 480 s vysokým rozlišením a HRAM

Hlavní výsledky a diskuse

FLD oddělil hlavní proteiny VP1, VP2 a VP3 a odhalil i odštěpky VP3. Poměr VP1 : VP2 : VP3 byl přibližně 1,3 : 1 : 10. MS dekonvoluce poskytla hmotnostní přesnost pod 3 ppm pro hlavní proteoformy i pod 10 ppm pro nízkoodborné formy. Analýza injekcí od 28 ng do 140 ng na kolónu potvrdila zachování kvality spektra i při minimálních množstvích. Top-down approach objasnil struktury VP3 clip (1–387) a C-terminálního fragmentu prostřednictvím HCD fragmentace a software BioPharma Finder.

Přínosy a praktické využití metody

• Unikátní kombinace vysoké citlivosti FLD a přesnosti HRAM MS pro QC virových vektorů.
• Schopnost detekovat a kvantifikovat i nízkomolekulární proteoformy.
• Top-down analýza umožňuje přímou potvrzení sekvence a identifikaci modifikací nebo degradací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj softwaru a masivní zvýšení rozlišení MS spolu s novými fragmentačními režimy umožní ještě detailnější charakterizaci proteoform na úrovni celých komplexů. Automatizace sample prep a pokročilé chromatografické režimy podpoří rychlejší a robustnější QC workflow pro klinické výrobní procesy.

Závěr

Platforma UHPLC-FLD-HRAM MS s Orbitrap Exploris 480 prokázala výjimečnou schopnost přesné, citlivé a komplexní analýzy intaktních AAV kapsidových proteinů i jejich nízkomolekulárních variací, což významně přispívá k pokročilému výzkumu a kontrole kvality virových vektorů.

Reference

• Samulski R J, Muzyczka N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annu. Rev. Virol. 2014;1(1):427–451.
• Naso M F, Tomkowicz B, Perry W L, Stroh W R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 2017;31:317–334.
• Dong B et al. Proteomics Analysis of Co-Purifying Cellular Proteins Associated with rAAV Vectors. PLoS ONE. 2014;9(2):e86453.
• Popa-Wagner R et al. Impact of VP1-Specific Protein Sequence Motifs on AAV2 Intracellular Trafficking. J. Virol. 2012;86(17):9163–9174.
• Van Vliet K M et al. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods Mol. Biol. 2008;437:51–91.
• FDA Guidance. Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Gene Therapy IND Applications. 2020.
• Jin X et al. Direct LC/MS Analysis for Complete Characterization of rAAV Capsid Proteins. Hum. Gene Ther. Methods. 2017;28(5):255–267.
• Liu A P et al. Characterization of AAV Capsid Proteins Using HILIC–MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2020;189:113481.
• Scheffler K, Viner R, Damoc E. High-Resolution Top-Down Experimental Strategies on the Orbitrap Platform. J. Proteomics. 2018;175:42–55.