New prm-PASEF for highly multiplexed targeted acquisition in clinical samples

Význam tématu

Moderní cílené proteomické metody vyžadují vysokou citlivost, selektivitu a schopnost analyzovat velký počet peptidů v průběhu krátkého chromatografického běhu. Technologie prm-PASEF kombinuje výhody zachycené iontové mobility (TIMS) s paralelním akvizičním schématem PASEF, čímž výrazně zvyšuje multiplexní kapacitu bez ztráty senzitivitě.

Cíle a přehled studie

Studie představuje nové schéma prm-PASEF pro vysoce multiplexní cílené akvizice na přístroji timsTOF Pro. Metoda byla validována pomocí směsi 201 těžkých (AQUA) peptidů a 14 lehkých peptidů přidaných do Hela celulárního lyzátu. Cílem bylo ukázat robustnost, kvantifikační přesnost a kapacitu metody při analýze klinických vzorků.

Použitá metodika

Vzorky byly separovány nano-HPLC na pulled emitter kolonkách s 30min gradientem. Během jednoho IMS skenu (100 ms) může být selektováno až 11 prekurzorů, které jsou následně paralelně fragmentovány ve collision cell. Data z akvizice prm-PASEF byla zpracována v softwaru Skyline-daily.

Použitá instrumentace

• nanoElute nano-HPLC (Bruker Daltonics)
• Pulled emitter kolony IonOpticks (250 mm)
• timsTOF Pro (Bruker Daltonics) v režimu ppm-PASEF (prototyp)

Hlavní výsledky a diskuse

• Multiplexní kapacita: během 30min LC běhu bylo monitorováno až 215 prekurzorů.
• Kalibrační křivky: rozsah od 5,5 do 50 000 amol/µl s přesností 80–120 % a limit kvantifikace (LOQ) definovaný na 3× SD blanku.
• Reprodukovatelnost: RSD procentuálních odchylek (accuracy) v inter­valu 0,6–5,2 %; RSD plochy chromatogramu pod 5 % u většiny peptidů.
• Časová rozlišení: typicky 10–15 datových bodů na chromatografický vrchol zajišťuje spolehlivou kvantifikaci i u ostrých píků.
• Selektivita a citlivost: zvýšená díky časově fokusovanému PASEF akvizičnímu schématu a filtrace v rámci iontové mobility.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda prm-PASEF nabízí:

• Výrazné zvýšení multiplexní kapacity cílených analýz bez kompromisu senzitivitě.
• Vysokou kvantitativní přesnost a reprodukovatelnost.
• Kompatibilitu s vysoce průchodnými postupy vhodnými pro analýzu rozsáhlých klinických kohort.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do klinické rutiny: přechod od výzkumných vzorků k diagnostickým aplikacím.
• Rozšíření multiplexu: cílení na tisíce prekurzorů pomocí optimalizovaného plánování PASEF eventů.
• Automatizace a reálné časové plánování analýzy na základě prediktivních modelů retenčních časů a IMS driftu.
• Využití v multi-omics: kombinace s dalšími analytickými platformami pro komplexní analýzu biomolekul.

Závěr

Prm-PASEF představuje průlomovou technologii pro cílenou proteomiku, která přináší vysokou multiplexní kapacitu, excelentní citlivost a selektivitu. Metoda je ideální pro vysoce průchodné a robustní kvantifikace velkého počtu peptidových markerů v klinických i výzkumných aplikacích.

Reference

Textové podklady neobsahovaly explicitní seznam literatury.