prm-PASEF®: enabling high-throughput, high sensitivity targeted proteomics

Význam tématu

Targeted proteomics představuje klíčový nástroj pro kvantifikaci vybraných proteinových markerů s vysokou citlivostí a selektivitou. Je nezbytná pro validaci biomarkerů ve výzkumu i klinické diagnostice, kde je nutné dosáhnout plné datové úplnosti, reprodukovatelnosti a nízkých limitů detekce.

Cíle a přehled studie

Studie představuje novou akviziční metodu prm-PASEF, která kombinuje paralelní akumulaci sériovou fragmentaci (PASEF) s cílenou proteomikou. Cílem bylo prokázat zvýšení multiplexní kapacity a citlivosti bez kompromisu v selektivitě během 30minutové LC separace lidského HeLa digestu.

Použitá metodika

Vzorek obsahoval 100 ng/µl HeLa cell line digest obohacený o 201 těžkých AQUA peptidů a 15 lehkých syntetických peptidů. Byla vytvořena diluční řada od 5,5 do 50 000 amol/µl. Vzorky byly analyzovány v triplikátu pomocí nanoUHPLC s gradientem 2–30 % acetonitrilu za 30 minut. Mass spektrometr timsTOF Pro pracoval v režimu prm-PASEF s akumulačním časem 50 ms a separací 100 ms, mobilitou 0,65–1,3 1/K0 a rozsahy m/z 100–1700.

Použitá instrumentace

• nanoElute UHPLC (Bruker Daltonics)
• Pulled emitter column 250 mm, IonOpticks
• timsTOF Pro (Bruker Daltonics) v režimu prm-PASEF
• Software Skyline-daily pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda monitorovala 216 prekurzorů během jedné 30minutové analýzy.
• Limit kvantifikace (LOQ) dosáhl 17,2 amol pro vybrané peptidy.
• Multiplexní kapacita průměrně 4 cílených iontů na PASEF frame, až 10 při vysoké hustotě.
• Linearita signálu přes více než 3 řády (17,2–50 000 amol) s přesností 80–120 %.
• Reprodukovatelnost RSD < 10 % i bez interního standardu.
• Průměrně 25 datových bodů na chromatografický vrchol zajišťuje správné sledování i při zkrácených gradientech.

Přínosy a praktické využití metody

Prm-PASEF umožňuje vysokopropustné cílené analýzy s krátkými chromatografickými běhy (až 5 min) a vynikající citlivostí. Metoda je vhodná pro velké soubory klinických vzorků, QA/QC v biotechnologiích a validaci biomarkerů s požadavkem na vysokou robustnost a přesnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace pracovních postupů a integrace do klinických laboratoří.
• Zvýšení multiplexní kapacity za využití rychlejších LC gradientů.
• Propojení s dalšími separačními technikami (mikroflow, kapilární LC).
• Hybridní přístupy spojující targeted a data-independent akvizice pro širší záběr proteomu.

Závěr

Prm-PASEF představuje inovativní aplikaci timsTOF Pro, která posouvá hranice cílené proteomiky kombinací vysoké citlivosti, rychlosti a selektivity. Metoda nabízí vynikající reprodukovatelnost a přesné kvantifikace i při velkém počtu analyzovaných cílů a krátkých gradientech, což ji činí perspektivní pro klinické a průmyslové nasazení.

Reference

Lesur A, Schmit P-O, Adams C, Dittmar G. prm-PASEF: enabling high-throughput, high sensitivity targeted proteomics. Bruker Daltonics Inc Application Note TN-52 Rev. 01, 10-2020.