Optimizing HPLC Separations: Samples with Widely Differing Polarities

Význam tématu

Separace směsí látek s širokým rozsahem polarity představuje výzvu v oblasti kapalinové chromatografie. Gradientní eluce je sice účinná, ale často časově náročná a vyžaduje složité přístrojové nastavení. Izokratické metody bez přídavných iontových párů nebo jiných aditiv nabízejí jednodušší a reprodukovatelnější alternativu, zejména pro rutinní analýzu vitaminů a farmakologicky aktivních sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentovaný materiál popisuje vývoj izokratické metody pro separaci deseti vodou rozpustných vitaminů (B1, B2, B6, B5, B12, biotin, niacin, niacinamid, kyselina listová, C) a dále jednoduchý isokratický postup pro analýzu paclitaxelu a jeho hlavního metabolitu 6α-hydroxypaclitaxelu. Článek předkládá praktická nastavení fáze, diskusi o vlivu polarity a ukazuje možnosti využití běžně dostupných reverzních fází.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolony: Discovery C18 (15 cm × 4,6 mm ID, 5 μm), C8 a RP-AmideC16 (15 cm × 4,6 mm ID, 5 μm) pro paclitaxel.
• Mobilní fáze pro vitaminy: 50 mM K2HPO4 pH 7/methanol v poměru 99:1 a 80:20 (vzrůstem % methanolu dvě izokratické kroky).
• Mobilní fáze pro paclitaxel: 30 mM NH4OAc/HOAc pH 4,5 : acetonitril 55:45.
• Detekce: UV při 220 nm (vitaminy), 230 nm (paclitaxel).
• Teplota column oven: 35 °C (vitaminy), 37 °C (paclitaxel).
• Injekční objem: 10 μL pro vitaminy, 20 μL pro paclitaxel.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro vitaminy byla navržena dvoukroková izokratická metoda: 1 % methanolu umožnilo separaci osmi vitaminů během ~10 min, následující krok s 20 % methanolu vyvolal rychlou eluci laterálně vázaných B2 a B12. Alternativně lze použít sekvenční běh dvou kolon nebo přepínání mezi fázemi. V případě paclitaxelu a 6α-hydroxypaclitaxelu bylo dosaženo kvalitního rozlišení na všech třech fázích, přičemž RP-AmideC16 prokázala jedinečnou selektivitu díky vodíkovým vazbám s aromatickými hydroxylovými skupinami diethylstilbestrolu (interní standard). Biologická matrice neovlivnila základní rozlišení ani selektivitu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zjednodušené přístrojové uspořádání a rychlejší optimalizace oproti gradientním programům.
• Odstranění potřeby iontových párů a dalších aditiv, kompatibilita s LC-MS.
• Možnost dlouhodobého provozu a snadné výměny méně nákladného guard column.
• Vhodné pro rutinní QA/QC i farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření izokratických přístupů na další skupiny biologicky významných látek, integrace vícekolónových systémů s automatickým přepínáním, systematické využití RP-Amide fází pro selektivní vazby a širší využití v hyphenovaných technikách LC-MS/MS. Dále se očekává rozvoj modulárních přístrojových uspořádání pro paralelní runy a online detekci.

Závěr

Prezentované izokratické metody na běžně dostupných reverzních fázích nabízejí efektivní, časově a nákladově úsporné řešení pro separaci látek s odlišnou polaritou. Díky své robustnosti a kompatibilitě s nejrůznějšími detekčními technikami jsou vhodné jak pro výzkumné, tak rutinní analytické laboratoře.

Reference

1. Machlin L.J. (ed.) Handbook of Vitamins, Marcel Dekker, New York, 1991.
2. Ottaway P.B. (ed.) The Technology of Vitamins in Food, Chapman & Hall, New York, 1993.
3. De Leenheer A.P., Lambert W.E., De Ruyter M.G.M. (eds.) Modern Chromatographic Analysis of the Vitamins, Marcel Dekker, New York, 1985.