Fast Gradients for RP-HPLC

Význam tématu

Stále vyšší požadavky na propustnost analytických laboratoří kladou důraz na zkrácení doby analýzy při zachování dostatečného rozlišení a citlivosti. Metoda rychlých gradientů ve spojení s krátkými kolonkami umožňuje výrazné zkrácení doby běhu v RP-HPLC bez ztráty chromatografické kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného materiálu je demonstrovat, jak použití krátkých kolonek (5 cm) s částicemi 5 µm a úprava gradientu a průtoku ovlivňuje dobu analýzy, rozlišení a provozní tlaky v RP-HPLC. Studie porovnává tradiční metody (15 cm kolony, gradient 10–80 % MeCN/21 min) s optimalizovanými protokoly pro vysokoprůtokové aplikace.

Použitá instrumentace

• Kolonky Discovery C18, C8 a RP-AmideC16: délky 5, 10 a 15 cm, průměr 4,6 mm, částice 5 µm
• Mobilní fáze: voda s 0,1 % kyseliny mravenčí a acetonitril (MeCN)
• Statické mixéry (Micro-Mixer a Low Volume Mixer) pro různé objemy 1–250 µL
• Detekce: UV-Vis, vlnová délka 220 nebo 254 nm, průtokové buněčky 1–15 µL

Metodika

Byly navrženy tři experimenty s parabeny na Discovery C18:

• Standardní kolona 15 cm, gradient 10–80 % B/21 min, průtok 1 mL/min
• Krátká kolona 5 cm, gradient 10–80 % B/7 min, průtok 1 mL/min
• Krátká kolona 5 cm, gradient 10–80 % B/1,75 min, průtok 4 mL/min

Dále byly demonstrovány příklady:

• Separační výkon u analytů z Excedrinu na kolonce C8: baseline rozlišení do 1,5 min
• Rychlá analýza OTC léku na RP-AmideC16 s segmentovaným gradientem (0–5 % B/0,5 min + 20–40 % B/1,5 min) při 3 mL/min
• Separace proteinů (<20 kDa) na C8 (5 cm) gradientem 0–50 % B/2,75 min

Hlavní výsledky a diskuse

• Zkrácení kolony z 15 na 5 cm s úpravou gradientu zkrátilo dobu analýzy až trojnásobně při zachování baseline rozlišení sedmi parabenů.
• Zvýšení průtoku na 4 mL/min umožnilo ukončit gradient pod 2 minuty se stále dostatečnou separací.
• Segmentovaný gradient dovolil rychlou a účinnou analýzu komplexních směsí (např. OTC produktů) během méně než 2 minut.
• Kolonky C8 pro proteiny poskytly rozlišení čtyř modelových bílkovin do 3 minut.
• Řešení minimalizace systému dwell volume (<50 µL) pomocí vysokotlakých mixérů zajišťuje úměrné zpoždění gradientu při úzkých borech (<2,1 mm ID).

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení propustnosti (throughput) při vysokém počtu vzorků.
• Možnost analýzy směsí širokého rozsahu polarity v jednom běhu.
• Snížení spotřeby organických rozpouštědel a času na re-ekvilibraci.
• Vysoká flexibilita při volbě délky kolony a průtoku podle aplikace (lékové profily, QC, proteomika).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkrácení běhů díky sloučení mikro- a nano-HPLC s ultra vysokotlakými systémy (UHPLC).
• Integrace on-line statických mixérů s přesnou regulací dwell volume.
• Automatizované optimalizační algoritmy gradientů pro specifické třídy sloučenin.
• Aplikace fast gradientů v LC-MS a multidimenzionálních systémech.

Závěr

Rychlé gradienty na krátkých RP kolonkách nabízejí optimální kompromis mezi rychlostí a rozlišením. Díky nižší zpětné tlakové zátěži a možnosti vyšších průtoků je metoda dobře použitelná pro vysokopropustné a široce variabilní analytické úlohy.

Reference

Goetzinger W.K., Kyroanos J.N. (1998) American Laboratory 30, 27–37
Weller H.N. et al. (1997) Molecular Diversity 3, 61–70