Accelerated method development for the separation of water-soluble vitamins by RP-HPLC with UV detection using an empirical approach to predict separation

Význam tématu

Voda rozpustné vitaminy (WSV) představují široce rozšířenou a biologicky významnou skupinu látek, jejichž správné stanovení je klíčové pro kontrolu potravin, nápojů a doplňků stravy. Různá polarita a strukturální rozmanitost WSV kladou vysoké nároky na chromatografickou separaci a často vyžadují složitější techniky, než je běžné RP-HPLC-UV.

Cíle a přehled studie

• Demonstrovat softwarově řízený empirický přístup k vývoji RP-HPLC-UV metody pro úplnou separaci všech známých WSV.
• Zrychlit vývoj metody pomocí prediktivního modelování retencí v ChromSword Offline.
• Dosáhnout přenositelnosti navržené metody s přesností předpovědi retenčních časů pod 1 minutu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla vyvinuta na základě počátečního screeningu čtyř C18 stacionárních fází (Hypersil GOLD aQ, Acclaim Polar Advantage II, Acclaim Polar Advantage, Accucore aQ) a různých vodných a organických elučních složek. Empirický postup spočíval ve třech až čtyřech isokratických experimentech (5–50 % methanolu), jejichž retenční data byla zadána do ChromSword Offline k predikci optimálního gradientu. Pro řešení rozdílné polarity analytů byl postupně navržen jeden společný 11minutový gradient s výchozí 5 % organiky.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Horizon (Base, Binary Pump H, Split Sampler HT, Column Compartment H, Diode Array Detector s LightPipe 10 mm)
• Software ChromSword Auto Developer a ChromSword Offline pro metodu a predikci
• Chromeleon 7.2.8 pro akvizici a zpracování dat
• Kolona Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ C18 (100 × 2,1 mm, 1,9 µm)

Hlavní výsledky a diskuse

Výběr Hypersil GOLD aQ C18 a mobilní fáze 50 mM amonného formiátu pH 3,8–methanol vedl k nejlepší separaci. Prediktivní model dosáhl rozdílů mezi experimentálními a předpovězenými retenčními časy menších než ±0,10 min pro šest vitaminů a do 1 min i pro zbývající tři. Konečný gradient umožnil baseline separaci všech devíti WSV do 11 minut. Metoda vykázala dobrou opakovatelnost (RSD retenčních časů <0,16 %, plošných integrálů <1 %, výjimkou pantothenové kyseliny a biotinu ~3 %) a lineární odezvu (R2 ≥ 0,9965). LOD/LOQ byly v rozmezí 0,03–0,40 µg/mL (nepolarita v řádu desítek µg/mL).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý vývoj metody během dvou dnů díky softwarové podpoře
• Kompletní baseline separace všech známých WSV na RP-HPLC-UV bez nutnosti MS detekce
• Vysoká přesnost predikce retenčních časů pro snadnou transferovatelnost mezi laboratořemi
• Dobrá opakovatelnost a citlivost vhodná pro rutinní analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Zavedení pokročilých prediktivních algoritmů a strojového učení by mohlo dále zkrátit optimizační cykly. Metodu lze rozšířit o další vitaminy nebo komplexní matrice, případně ji automatizovat v rámci laboratoří s vysokou průchodností vzorků. Kombinace s hmotnostní detekcí zvýší selektivitu v náročných vzorkových matricích.

Závěr

Empirický softwarový přístup využívající ChromSword Offline umožnil rychlý vývoj a predikci gradientního RP-HPLC-UV rozdělení všech známých WSV s vynikající shodou mezi předpovědí a experimentem. Výsledná 11minutová metoda poskytuje spolehlivé, opakovatelné a přenositelné stanovení WSV v potravinách, nápojích a doplňcích.

Reference

1. Kamangar F., Emadi A. Vitamin and Mineral Supplements: Do We Really Need Them? Int. J. Prev. Med. 2012;3(3):221–226.
2. Walash M.I., Sheribah Z.A., Salim M.M. Kinetic Spectrophotometric Determination of Biotin in Pharmaceutical Preparations. Int. J. Biomed. Sci. 2008;4(3):238–245.