New Paradigm for HPLC Method Development

Význam tématu

Reverzní fáze HPLC představuje základní analytický nástroj v oblasti farmaceutického vývoje. Umožňuje rychlou a citlivou separaci komplexních směsí, a to od vysokopropustných screeningů až po detailní analýzy metabolitů. Optimalizace selektivity metod RP-HPLC šetří čas i náklady a je nezbytná pro splnění požadavků na kvalitu a reprodukovatelnost v laboratorní a průmyslové praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje nový přístup k vývoji metod RP-HPLC založený na systematickém výběru a porovnávání různých typů stacionárních fází. Cílem je demonstrovat, jak polar-embedded fáze (Discovery RP-AmideC16) a další členové řady Discovery (C18, C8, Cyano) mění selektivitu a zkracují dobu vývoje metod. Prostřednictvím řady praktických případů (OTC léky, fluorochinolonová a β-laktamová antibiotika, léčiva typu diphenylmethanu) je ilustrováno rychlé screenování fází a řešení kritických párů separací.

Použitá instrumentace

• HPLC kolony Supelco Discovery RP-AmideC16, C18, C8, Cyano (rozměry 4.6×50 nebo 4.6×150 mm, 5 µm částice)
• Rheodyne LabPro Column Selector pro automatické přepínání až mezi 6 kolony
• Mobilní fáze: kyselina mravenčí, fosfátové pufry (pH 2.5–7), acetonitril
• Proudění mobilní fáze 1–4 mL/min, teplota kolony 25–35 °C
• Detekce UV při 220 nm a 254 nm

Hlavní výsledky a diskuse

• RP-AmideC16 poskytla v gradientních i isokratických bězích optimální rozlišení OTC složek (pseudoefedrin, acetaminofen, chlorfeniramin, dextromethorfan) ve srovnání s C8, C18 a Cyano, které vykazovaly buď špatnou retenci, nebo přetížení.
• Ve skupině fluorochinolonů RP-AmideC16 zajistila baseline separaci kritického páru ofloxacinu/norfloxacinu díky vodíkovému vazebnímu efektu mezi piperazinovým kruhem a amido funkčností.
• Pro β-laktamová antibiotika (peniciliny G, V, amoxicilin, ampicilin, piperacilin, cloxacilin) byly všechny složky rozlišeny na alkylovaných fázích C8, C18 i RP-AmideC16, zatímco na Cyano byla nutná pozvolnější gradientní eluce kvůli omezené hydrofobní diskriminaci.
• Při práci s krátkými kolonami (50 mm) je nutné kontrolovat hromadné přetížení vzorku, jinak dochází k deformacím píku i posunu retencí.

Přínosy a praktické využití metody

Systematické srovnávání stacionárních fází zkracuje vývojové cykly, usnadňuje výběr optimální kolony pro konkrétní analytickou úlohu a podporuje robustnost metod při přechodu na LC-MS. Automatizované přepínání kolony pomocí LabPro umožňuje efektivní screenování bez ruční manipulace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření polar-embedded a jiných modulárních fází pro zlepšení separace polárních a iontových látek. Integrace s modelovacím softwarem, plná automatizace přepínání kolony a rozšíření kompatibility s hmotnostní spektrometrií slibují další zrychlení vývoje a zvýšení reproducibility metod.

Závěr

Nový paradigmatický přístup, založený na počátečním screeningu různých bonded fází a cíleném využití vodíkových i hydrofobních interakcí, vede k rychlejší a spolehlivější optimalizaci RP-HPLC metod. Přístup je zvláště přínosný při práci s komplexními farmaceutickými směsmi a náročnými analýzami v oblasti výzkumu i průmyslu.

Reference

• R.K. Gilpin and L.A. Pachia. Anal. Chem., 71, 217R–233R (1999).
• J. Zweigenbaum et al. Anal. Chem., 71, 2294–2300 (1999).
• L. Huber. Biopharm, 12, 64–66 (1999).
• R.E. Majors. LC-GC, 17, 212–228 (1999).
• P.T. Jackson and P.W. Carr. Chemtech, 29–37 (1999).
• L.R. Snyder. J. Chromatogr. B, 689, 105–115 (1999).
• L.R. Snyder, J.J. Kirkland and J.L. Glajch. Practical HPLC Method Development, Wiley, New York (1997).
• R. Stevenson. American Laboratory, 31(23), 4–8 (1999).