Analysis of N-Linked Glycan using MALDImini™-1 Compact MALDI Digital Ion Trap Mass Spectrometer: Structural Analysis and Identification of Sialyl Linkage Isomers

Význam tématu

Analýza N-vázaných glykanů a především rozlišení izomerů sialylace (α2,3 vs. α2,6) je klíčová pro pochopení biologických procesů, onemocnění a vývoje biotechnologických léčiv. Stabilizace a identifikace vazeb sialových kyselin podporuje odhalení jejich úlohy v antigenicitě, virových infekcích a dalších patologických stavech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku bylo demonstrovat využití metody SALSA (Sialic Acid Linkage Specific Alkylamidation) v kombinaci s MALDI-DIT hmotnostní spektrometrií (MALDImini-1) pro:

• stabilizaci sialových zbytků před analýzou
• rozlišení α2,3- a α2,6-sialylace pomocí hmotnostních rozdílů
• detailní strukturní charakterizaci glykanů včetně vazeb a sekvence monosacharidů prostřednictvím MSn analýzy

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval tyto kroky:

• Uvolnění N-vázaných glykanů: denaturace sérového proteinu SDS/DTT, přidání NP-40 a enzymu PNGaseF při 37 °C po 18 h.
• SALSA modifikace: dvojstupňová alkaloylide natizace, kde α2,6-sialové kyseliny jsou amidovány isopropylaminem (iPA) a α2,3-sialové kyseliny methylaminem (MA), následné odstraňování přebytku činidla GL-Tip Amide.
• 2AB značení: navázání 2-aminobenzamidu na redukující konec glykánu a čištění přebytečného činidla.
• MALDI-DIT MS: nanesení vzorku s matricí CHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) na MALDI destičku a analýza v MS, MS2 a MS3 režimech pomocí přístroje Shimadzu MALDImini-1.

Hlavní výsledky a diskuse

MS1 spektra prokázala detekci biantennárních i triantennárních komplexních glykanů.
MS2 analýzou došlo k odlišení izomerů díky hmotnostnímu rozdílu neutralního ztrátového iontu modifikované sialové kyseliny (28, 59 a 0 Da).
MS3 analýza fragmentů umožnila lokalizovat vzniklý iont m/z 720.0 na ne-redukující terminál sialové větve a odhalit konstituční sekvenci glykánu (např. fragmenty core struktury m/z 1053.4).
Rozdíl hmotností mezi izomery triantennárního glykánu (m/z 3117.1 jako smíšená α2,3/α2,6 a m/z 3145.2 čistě α2,6) potvrdil účinnost SALSA metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje současnou stabilizaci a diferenciaci vazeb sialylace bez potřeby separačních technik HPLC. Rychlá příprava vzorku, minimalizace ztrát sialových zbytků, možnost hloubkové charakterizace glykánových izomerů a přímá aplikace na sérové vzorky činí protokol vhodným pro biomedicínský výzkum, QA/QC biotechnologických produktů a virovou glykomiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření SALSA protokolu na:

• analýzu glykolipidů a proteoglykanů
• automatizovaná on-line řešení propojená s LC-MS/MS
• vývoj kvantitativních metod pro biomarkery sialylace
• aplikace v glykoengineeringu buněk a glyko-profilování virů

Závěr

Kombinace sialové stabilizace SALSA a MSn analýzy na MALDImini-1 přístroji představuje efektivní přístup ke komplexní strukturní charakterizaci N-vázaných glykanů včetně rozlišení vazeb sialylace. Metoda nabízí rychlou, citlivou a vysoce specifickou platformu pro glykomické studie.

Reference

1. Nishikaze T. et al. Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling. Anal Chem. 2017;89:2353–2360.
2. Hanamatsu H. et al. Sialic Acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones. Anal Chem. 2018;90(22):13193–13199.