Sialic Acid Linkage Isomer Discrimination of N-glycans derived from Rat Cochlea using SialoCapper-ID Kit

Význam tématu

Analýza vazebních izomerů sialových kyselin (α2,3 vs α2,6) na koncích N-glykanů je klíčová pro pochopení biologických procesů, jako je nádorová progresivita nebo virová infekce.
Tradiční metody vyžadují složité LC rozdělení a srovnávání s referenčními standardy.
Vyvinutý SialoCapper™-ID Kit zjednodušuje postupy a umožňuje rychlou detekci vazebních izomerů přímo z MS1 dat MALDI-TOF.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat aplikaci SialoCapper™-ID kitu na PA-označené N-glykany izolované z ratích kochleí a ukázat diskriminaci α2,3/α2,6 vazebních izomerů pomocí MALDI-TOF MS bez nutnosti LC separace.
Studie zahrnovala:

• Izolaci a frakcionaci N-glykanů z glykoproteinů stria vascularis ratího labyrintu.
• Zjištění hlavních struktur proteinových zbytků 2-D HPLC a LC/MS.
• Specifickou derivatizaci sialových kyselin SALSA postupem s použitím SialoCapper™-ID kitu.
• Hmotnostní analýzu prostřednictvím MALDI-TOF MS (MALDI-8020).

Použitá metodika

• Uvolnění N-glykanů hydrazinolýzou a označení 2-aminopyridinem (PA).
• Frakcionace podle počtu sialových zvyšků: DEAE HPLC → RP-HPLC → NP-HPLC + LC-MS.
• Dvoustupňová derivatizace SALSA: nejprve amidace iPA pro α2,6-posloupnosti, poté MA pro α2,3-vazby; odstranění přebytku reaktantů HILIC-SPE.
• MALDI-TOF MS analýza: aplikace vzorku s matricí CHCA + NaCl na desku MALDI-8020, záznam MS1 spekter.

Použitá instrumentace

• MALDI-TOF hmotnostní spektrometr Shimadzu MALDI-8020.
• HPLC systémy pro DEAE aniontovou výměnu, RP-HPLC (ODS kolona), NP-HPLC (amidová kolona).
• LC-MS pro 2-D analýzu glykanů.
• SialoCapper™-ID derivatizační kit a HILIC-SPE čip pro čištění derivátů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Derivatizací SALSA se mění hmotnost sialových zbytků specificky podle vazby: α2,6 +59 Da, α2,3 +28 Da.
• U frakcí A1-14 (jedna sialová kyselina) detekována posunutá stopa m/z 2383,4, odpovídající α2,6-vazbě.
• U komplexních tetraantennárních glykanů se dvěma sialovými zbytky rozlišení vazeb proběhlo přímo z MS1 dat bez další LC separace.
• Metoda prokázala vysokou selektivitu a konzistenci s předpokládanými strukturami z HPLC/LC-MS analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace potřeby časově náročné LC separace pro vazební izomery.
• Rychlá identifikace typu vazby přímo z MALDI-TOF spekter.
• Snadná integrace do stávajících glykanových workflow bez změn značení.
• Vhodné pro více vzorků a vysokopropustné analýzy ve výzkumu a QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření SALSA derivatizace na ostatní typy glykokonjugátů (glykolipidy, O-glykany).
• Kombinace s automatizovanými MALDI platformami pro vysokopropustný screening.
• Integrace do kvantitativních metod LC-MS/MS pro hlubší strukturální charakterizaci.
• Využití v biomarkerových studiích zaměřených na glykoizomery v klinických vzorcích.

Závěr

SialoCapper™-ID Kit umožňuje selektivní derivatizaci a jednoduchou diskriminaci sialových vazebních izomerů α2,3/α2,6 na PA-glykanech pomocí MALDI-TOF MS bez nutnosti LC kroků. Tím se zrychluje analytický workflow a rozšiřuje aplikovatelnost glykanové analýzy ve výzkumu a průmyslové praxi.

Reference

1. Nonomura Y, et al. Characterisation of N-glycans in the epithelial-like tissue of the rat cochlea. Sci Rep. 2019;9:1551.
2. Nishikaze T, et al. Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling. Anal Chem. 2017;89:2353–2360.
3. Hanamatsu H, et al. Sialic Acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones. Anal Chem. 2018;90:13193–13199.