Development of a ClinicalResearch Method for theMeasurement of Testosteroneand Dihydrotestosterone

Význam tématu

Precizní stanovení androgenních steroidů testosteronu a dihydrotestosteronu (DHT) je klíčové pro klinický výzkum i laboratorní diagnostiku hormonálních poruch. Přímá analýza těchto látek v nízkých koncentracích, zejména u žen a pediatrických pacientů, představuje výzvu z důvodu omezené citlivosti a specificity běžných imunologických testů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a spolehlivou LC-MS metodu s online SPE pro simultánní kvantifikaci testosteronu a DHT v plazmě bez nutnosti chemické derivatizace. Studie sledovala optimalizaci vzorkové přípravy a chromatografických podmínek za využití systémů ACQUITY UPLC a Xevo TQ-S.

Použitá metodika a instrumentace

• LC-MS: ACQUITY UPLC spojené s Xevo TQ-S
• Kolona: BEH C18, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm
• Online SPE: MassTrak C8 OSM kazeta, ACQUITY UPLC Online SPE Manager
• Příprava vzorku: 200 µl plazmy, interní standardy d3-testosteron a 13C3-DHT, precipitace proteinu roztokem ZnSO4/MeOH, následné naředění a přímá injekce (25 µl)
• Chromatografie: gradient MeOH/0,05 % kyseliny mravenčí při 0,4 ml/min
• Online SPE kroky: kondice, ekvilibrace, naložení vzorku, dvoustupňové promytí a rychlá eluční fáze (0,8 min)

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace pomocí Design of Experiments a AMD režimu výrazně urychlila identifikaci klíčových parametrů SPE.
• Testosteron a DHT byly kvalitně separovány a kvantifikovány v mužských vzorcích (20–65 let) s dostatečnou citlivostí.
• V premenopauzálních ženských vzorcích byl testosteron detekovatelný v pM koncentracích, DHT byl pod mezí kvantifikace.
• Celkový čas analýzy na vzorek činil méně než 5 min, metoda nepotřebuje derivatizaci a minimalizuje zásahy do vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá a plně automatizovaná příprava vzorku pro rutinní výzkumné aplikace.
• Vysoká citlivost a specifičnost umožňují spolehlivá měření u obou pohlaví i dětských pacientů.
• Rychlost analýzy podporuje vysokou průchodnost vzorků v laboratoři.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozšířit o další steroidní metabolity či modifikovat pro foukačkovou masovou spektrometrii s vyšším rozlišením. Kombinace online SPE s novými biomarkery androgenní osy otevře dveře pro rozsáhlé klinické studie a personalizovanou medicínu.

Závěr

Vyvinutá LC-MS metoda s online SPE nabízí rychlý a přesný nástroj pro simultánní stanovení testosteronu a DHT v plazmě bez derivatizace. Díky vysoké citlivosti a automatizaci je vhodná jak pro výzkumné, tak potenciálně i rozšířené klinické aplikace.

Reference

van Faassen M, Kema I. Development of a Clinical Research Method for the Measurement of Testosterone and Dihydrotestosterone. University Medical Center Groningen; 2014.