Determination of Drug-to-Antibody Ratio for Antibody-Drug Conjugates Purified from Serum

Význam tématu

Monoklonální protilátky vázané na cytotoxická léčiva (ADC) nabízejí specifickou cílenou terapii s vysokou účinností a nižšími vedlejšími účinky. Kritickou vlastností ADC je poměr počtu léčiv na protilátku (DAR), který ovlivňuje farmakokinetiku, účinnost a toxicitu. Spolehlivé stanovení DAR ve vzorcích ze séra je proto nezbytné pro vývoj, kontrolu kvality a farmakokinetické studie ADC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vytvořit zcela automatizovaný a vysoce reprodukovatelný workflow pro stanovení DAR v ADC purifikovaných ze séra. Studie kombinuje

• afinitní purifikaci na platformě Agilent AssayMAP Bravo,
• analýzu intact proteinů LC/MS na Agilent 1290 Infinity UHPLC a Agilent 6550 Q-TOF,
• software MassHunter BioConfirm pro dekonvoluci spekter,
• MassHunter DAR Calculator pro výpočet DAR.

Zaměření je na snížení manuální práce, variability a rizika chyb.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Biotinylace antigenu HER2 ECD a imobilizace na SA-W kartridže pomocí Agilent AssayMAP Bravo.
• Automatizovaná afinitní purifikace ADC ze sér pomocí optimalizovaných pufrů a peruštících centrifugálních kroků.
• Separace intact ADC gradientem formiát–acetonitril na PLRP-S kolóně a akvizice spekter v módu MS only (1 000–4 500 m/z).
• Extrakce a dekonvoluce spekter softwarem MassHunter BioConfirm (Maximum Entropy) s nastavením pro 140–160 kDa.
• Výpočet DAR a distribuce šarží lékových zátěží pomocí MassHunter DAR Calculator.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo platforma pro automatizovanou afinitní purifikaci.
• Agilent 1290 Infinity UHPLC se sloupcem PLRP-S 1000Å 8 µm 150×2,1 mm.
• Agilent 6550 iFunnel Accurate-Mass Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem.
• Software Agilent MassHunter BioConfirm a DAR Calculator.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou účinnost purifikace a minimální nespecifické vazby. Chromatogramy komerčního ADC a purifikovaného ze séra byly srovnatelné, deformované signály soli a proteiny mimo okno eluce neovlivňovaly ionizaci. Průměrné DAR bylo 3,5 pro komerční i purifikované vzorky. Reprodukovatelnost byla velmi dobrá (CV <10 % pro koncentrace ≥1,25 µg/mL). Při nižších koncentracích lze výrazně zvýšit podíl injikovaného eluátu nebo provést deglykozylaci pro zlepšení kvality spekter.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace odstraňuje manuální kroky, snižuje variabilitu a riziko lidských chyb, umožňuje škálovat počet vzorků a zkracuje dobu analýzy. Workflow je vhodné pro rutinní stanovení DAR v PK studiích, QC laboratořích bioprocesů i výzkumných projektech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry rozvoje:

• Zařazení deglykozylace pro zjednodušení spekter a zlepšení poměru signál/šum.
• Úprava injikovaného objemu nebo koncentračního kroku pro nižší detekční meze.
• Adaptace na různé ADC formáty, včetně nových linkérů a cytotoxinů.
• Integrace do komplexních in vivo PK/PD studií a real-time monitoringu DAR v circulujících vzorcích.

Závěr

Představené řešení spojuje plně automatizovanou afinitní purifikaci, vysoce přesnou LC/MS analýzu intact proteinů a specializovaný softwarový balík pro dekonvoluci a výpočet DAR. Metoda dosahuje vysoké citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti a je připravena pro nasazení v průmyslových i akademických laboratořích.

Reference

1. Perez HL et al. Antibody-drug conjugates: current status and future directions. Drug Discovery Today 2014;19(7):869–881.
2. Beck A et al. Cutting-edge mass spectrometry methods for the multi-level structural characterization of antibody-drug conjugates. Expert Rev Proteomics 2016;13(2):157–183.
3. Xu K et al. Characterization of intact antibody-drug conjugates from plasma/serum in vivo by affinity capture capillary liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Biochem 2011;412:56–66.