Drug-to-Antibody Ratio (DAR) Calculation of Antibody-Drug Conjugates (ADCs)

Význam tématu

Antibody–drug conjugáty (ADC) představují pokročilou skupinu bioterapeutik, která kombinují specifické monoklonální protilátky s vysoce účinnými cytotoxickými látkami. Měření poměru počtu navázaných léčiv (DAR) je klíčové pro optimalizaci účinnosti, farmakokinetiky i bezpečnostního profilu ADC.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikacni note bylo ukázat rychlou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení DAR u ADC využitim automatizovaného vzorkovych pripravy a pokrocile LC/MS analýzy. Porovnány byly ctyri stavy vzorku (intaktni nebo redukovane a s/bez deglykozylace) v osmi replikatech.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky ADC byly pripraveny na automatickem pracovisti AssayMAP Bravo s reagentem rapid PNGase F pro vysokoce rychlou deglykozylaci a DTT pro redukci disulfidickych vazeb. Pro chromatografii a hmotnostni spektrometrii byla použita sestava:

• Agilent 1290 Infinity UHPLC s kolonkou PLRP-S (1000 Å, 2.1×150 mm, 8 µm)
• Agilent 6550 iFunnel Q-TOF se zdrojem Dual Jet Stream ESI
• Software Agilent MassHunter Qualitative Analysis s BioConfirm a DAR Calculator

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktni glykozylovane ADC vykázaly prumerny DAR 3.6 (%CV=0), po deglykozylaci se hodnota zvyšila na 3.88 (%CV=1.1). U redukovanych vzorku byly prumerne hodnoty DAR 3.23 (%CV=2.2) pro glykozylovane a 3.21 (%CV=2.6) pro deglykozylovane. Automatizace pripravy snížila variabilitu, zvysila citlivost zvlast pri analyzech lehkeho retezce a urychlila prubeh na mene nez hodinu.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovane platforma nabizi vysokou reprodukovatelnost, minimalizuje riziko lidske chyby, umoznuje paralelni pripravu 8–96 vzorku a zkracuje casovou narocnost pripravy. Kombinace s vysoce rezolucním LC/MS pristrojem a pokrocilou analytickou softwarovou platformou zjednodusuje a zrychluje ziskani presneho DAR.

Budoucí trendy a možnosti využití

Ocekava se dalsi rozsireni automatizace pripravy pro vyssi propustnost a integrace s platformami pro vyssi urovne multiplexni analýzy. Vylepšení algoritmu dekonvoluce a softwaru muze zajistit detailnejsi rozliseni glykoformnich struktury a modifikaci retezcu.

Závěr

Prezentovana metoda spojuje automatizovanou vzorkovou pripravu s rychlou deglykozylaci, optimalni chromatografii a presnou LC/MS analýzu pro efektivni a reprodukovatelne stanovení DAR ADC. Tento pristup usnadní vývoj a kontrolu kvality ADC v rozsahlejsich farmaceutickych bytech.

Reference

• Perez H L et al. Antibody-drug conjugates: current status and future directions. Drug Discovery Today 2014, 19(7), 869-881.
• Basa L. Drug-to-Antibody Ratio (DAR) and Drug Load Distribution by LC-ESI-MS. In: Antibody Drug Conjugates. Methods in Molecular Biology 1045, Humana Press 2013, 285-293.