An Integrated LC-MS Platform for Multi-Attribute Monitoring of CQA’s of mAbs at the Subunit Level

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčovými bioterapeutiky, přičemž jejich biologická aktivita, stabilita a účinnost závisí na strukturní heterogenitě a chemických modifikacích. Monitorování kritických kvalitativních atributů (CQA), jako je glykování, fucosylace či aglykozylace, poskytuje důležité informace pro bezpečnost, účinnost a regulační soulad těchto léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat integrovanou platformu pro multi-atributové monitorování (MAM) CQA mAb na úrovni podjednotky. Autoři ukazují jednoduchý workflow zahrnující enzymatickou přípravu vzorku, rychlou LC separaci a vysoce rozlišenou hmotnostní spektrometrii spolu s automatizovaným zpracováním dat v softwaru UNIFI za účelem kvantifikace fucosylace, afukosylace a aglykozylace scFc podjednotek.

Použitá metodika a instrumentace

Princip metody spočívá v digesci trastuzumabu enzymy IdeS (FabRICATOR) a endoglykozidázami Endo S nebo Endo S2 za vzniku podjednotek scFc a F(ab). Zachování jednoho GlcNAc (± fukóza) nebo jeho absence umožňuje jednoduchou diferenciaci modifikací.

• Chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class Bio System s BEH C4 kolonou 80 °C, 3,0min gradient, průtok 0,4mL/min, detekce UV 280 nm
• Hmotnostní spektrometrie: Waters Vion IMS QTof, ESI pozitivní mód, m/z 500–4000, kapilární napětí 2,75kV, konus 70V, desolvační teplota 600 °C
• Software: UNIFI Scientific Information System 1.8.2, MaxEnt1 dekonvoluce, vlastní výpočty relativní abundance CQA

Hlavní výsledky a diskuse

Platforma umožnila separaci a dekonvoluci scFc podjednotek s přesností hmotnosti pod 5ppm. Analýza dvou šarží trastuzumabu prokázala srovnatelnou relativní abundanci fukosylovaných, afukosylovaných a aglykozylovaných forem.
Opakovatelnost instrument–instrument a den–den vykázala RSD <10 % pro všechny sledované modifikace, čímž byla potvrzena robustnost metody. Srovnáním vzorků ošetřených Endo S a Endo S2 bylo možné kvantifikovat podíl vysokomannosových a hybridních glykanů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zjednodušená a rychlá příprava vzorku vhodná pro near real-time monitoring
• Minimalizace složitosti dat díky analýze na úrovni podjednotek
• Automatizované zpracování a reporting v UNIFI umožňuje snadné nasazení v R&D i QC prostředí
• Možnost rozšíření na další CQA (oxidace, deamidace) díky vstupním výpočtům
• Dodržitelnost regulačních požadavků a šablon ICH Q2R1

Budoucí trendy a možnosti využití

Multi-atributové monitorování se bude rozšiřovat o kontinuální systémy sledování výrobního procesu, kombinaci s dalších separačními technikami (IMS, kapilární elektroforéza) a integraci do digitalizovaných postupů kvality. Standardizace workflow a validace MAM může výrazně zkrátit čas vývoje a zvýšit rychlost uvedení mAb na trh.

Závěr

Integrovaná LC-MS platforma ve spojení s UNIFI představuje efektivní, citlivý a robustní nástroj pro monitoring CQA mAb na úrovni podjednotek. Metoda umožňuje přesné kvantifikace glykánových modifikací s vysokou opakovatelností a je připravena pro aplikace v procesním vývoji i rutinním QC.

Reference

1. Xu W, Jimenez RB, Mowery R, Luo H, Cao M, Agarwal N, Ramos I, Wang X, Wang J. A Quadrupole Dalton-Based Multi-Attribute Method for Product Characterization, Process Development, and Quality Control of Therapeutic Proteins. mAbs. 2017;9(7):1186-1196.
2. Bomans K, Haberger M, Bonnington L, Wagner K, Kailich T. Multi-Attribute Monitoring of Antibody Modifications by Semi-Automated Liquid Chromatography Mass Spectrometry Peptide Mapping. American Pharmaceutical Review. 2016.
3. Upton R, Bell L, Guy C, Caldwell P, Estdale S, Barran PE, Firth D. Orthogonal Assessment of Biotherapeutic Glycosylation: A Case Study Correlating N-Glycan Core Afucosylation of Herceptin with Mechanism of Action. Analytical Chemistry. 2016;88(20):10259-10265.
4. Haberger M, Bonnington L, Bomans K, Maier M, Eltner S, Dembowski M, Reush D, Bulau P. Application of Electrospray Ionization Mass Spectrometry in a Quality Control Laboratory. American Pharmaceutical Review. 2016.
5. Sokolowska I, Mo J, Dong J, Lewis MJ, Hu P. Subunit Mass Analysis for Monitoring Antibody Oxidation. mAbs. 2017;9(3):498-505.
6. Dong J, Migliore N, Mehrman SJ, Cunningham J, Lewis MJ, Hu P. High-Throughput, Automated Protein A Purification Platform with Multiattribute LC–MS Analysis for Advanced Cell Culture Process Monitoring. Analytical Chemistry. 2016;88(17):8673-8679.
7. Chung S, Quarmby V, Gao X, Ying Y, Lin L, Reed C, Fong C, Lau W, Qiu ZJ, Shen A, Vanderlaan M, Song A. Quantitative Evaluation of Fucose Reducing Effects in a Humanized Antibody on Fcγ Receptor Binding and Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Activities. mAbs. 2012;4(3):326-340.
8. Shields RL, Lai J, Keck R, OConnell LY, Hong K, Meng YG, Weikert SH, Presta LG. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcγRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 2002;277(30):26733-26740.
9. Waters Corporation. Biopharmaceutical Platform Solution with UNIFI - Key Applications. Application Notebook. 720004887EN. 2017.