High-Performance Vion IMS QTof for Monoclonal Antibody Intact and Subunit Mass Analysis

Význam tématu

Bioterapeutické protilátky, zejména monoklonální protilátky (mAb), jsou vysoce heterogenní molekuly s posttranslačními modifikacemi a výrobními variantami. Přesné stanovení jejich molekulové hmotnosti a kvantitativní profilování glykoform je nezbytné pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčiv. Vysokorozlišení hmotnostní spektrometrie umožňuje rychlou a spolehlivou charakterizaci intactních protilátek i jejich subjednotek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat výkon systému Waters Vion IMS QTof spojeného s informatikou UNIFI pro analýzu intactních mAb a jejich subjednotek. Studie zahrnuje stanovení citlivosti, přesnosti hmotnostního měření, reprodukovatelnosti kvantifikace glykoform a jednoduchost pracovního postupu při charakterizaci proteinu.

Použitá metodika

Analýza intactních protilátek:

• Příprava roztoků standartních mAb (Waters a NIST) v amon­ho­or­bónátu amonném (25 mM).
• Rozpětí koncentrací od 0,01 do 1 µg/µL pro stanovení detekční citlivosti (1–1000 ng na kolonu).
• Ultra­výkonná kapalinová chromatografie (ACQUITY UPLC H-Class Bio) s C4 kolonkou (1,7 µm, 2,1×50 mm), teplota kolony 80 °C, gradientní eluce se 0,1 % kyselinou mravenčí.

Analýza subjednotek (trastuzumab):

• Digestion s IdeS (37 °C, 30 min), následná redukce DTT v TRIS pufru s Guanidinem (37 °C, 30 min).
• Ukončení reakce 3 % acetonitrilem s 0,1 % formicovou kyselinou, injekce 1 µL 0,1 µg/µL roztoku.

Použitá instrumentace

• Vion IMS QTof Mass Spectrometer (Waters) s ADC2 detektorem QuanTof2™ a vylepšeným vakuovým systémem
• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• ACQUITY UPLC Tunable Ultraviolet (TUV) Detector
• BEH Technology™ Protein BEH C4 kolona
• UNIFI Scientific Information System pro řízení, zpracování a reporting

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost intactní analýzy umožnila detekovat mAb již při 1 ng on-column, s limitem detekce až 0,1 ng.
• Přesnost měření hmotnosti pro klíčové glykoformy intactních mAb (Waters, NIST) byla <10 ppm.
• Relativní kvantifikace pěti hlavních glykoform vykázala v 11 vstupech %RSD <1,5 %, což svědčí o vysoké reprodukovatelnosti.
• Subjednotková analýza trastuzumabu (scFc, LC, Fd) potvrdila výborné rozlišení a vysoký poměr signál/šum, s hmotnostní přesností <10 ppm a retenčními časy pro scFc (5,19 min), LC (5,93 min) a Fd (7,56 min).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a minimální potřeba ladění instrumentu pro intactní proteiny.
• Vysoká citlivost umožňující analýzu nízkých množství vzorku pro QC a vývoj.
• Workflow-řízený software UNIFI zrychluje akvizici, dekonvoluci a reporting.
• Spolehlivá přesnost a reprodukovatelnost hmotnostních dat a kvantifikace glykoform.
• Kompatibilita s regulovanými prostředími díky compliant-ready softwaru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Analýza intact a subjednotek mAb s IMS QTof lze dále rozšířit o:

• Integraci s pokročilými LIMS a automatizovanými procesy pro vysokopropustné laboratoře.
• Aplikaci umělé inteligence pro zrychlené zpracování a predikci posttranslačních modifikací.
• Adaptaci metodiky na další třídy bioterapeutik (Fc-fúze, bispecifické protilátky, nanobody).
• Optimalizaci citlivosti a přesnosti pomocí nových detekčních modulů a vylepšených datových algoritmů.

Závěr

Systém Waters Vion IMS QTof v kombinaci s UNIFI poskytuje robustní platformu pro charakterizaci intactních mAb i jejich subjednotek. Metoda nabízí vynikající citlivost, vysokou hmotnostní přesnost (<10 ppm) a reprodukovatelnost kvantifikace glykoform (<1,5 % RSD), což usnadňuje vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik. Automatizovaný pracovní postup podporuje rychlé výstupy a splňuje požadavky regulovaných prostředí.