Quick screening of intact antibody and antibody-drug conjugates with integrated microfluidic capillary electrophoresis and mass spectrometry

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) a jejich konjugáty s lékovými molekulami (ADC) představují klíčovou skupinu moderních bioterapeutik. V průběhu vývoje a výroby se však na úrovni intact proteinu mohou vytvářet nežádoucí varianty způsobené post-translačními modifikacemi či náhodnými přidanými skupinami. Rychlé a spolehlivé metody pro screening těchto heterogenních vzorků jsou nezbytné pro zajištění konzistence, bezpečnosti a účinnosti finálního farmaceutika.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace je demonstrovat integrovaný workflow založený na mikrosystémové kapilární elektroforéze (ZipChip CE) spojené s Orbitrapovým hmotnostním spektrometrem Q Exactive v režimu vysoké hmotnostní oblasti (HMR). Tento přístup umožňuje v čase kratším než 3 min rychle oddělit a charakterizovat varianty intact mAb a ADC, včetně odlišného obsahu C-terminálních lyzinů a různých glykoforem.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapilární elektroforéza (ZipChip HR chip) s background elektrolytem 10 % isopropylalkoholu a 0,2 % octové kyseliny, tlaková injekce 2 psi, analýza 3 minuty.
• Hmotnostní spektrometrie (Q Exactive Plus BioPharma, HMR režim) s rozsahem m/z 2 500–6 000, rychlost 12 skanů/s, in-source CID 100 eV.
• Softwarová analýza (Thermo BioPharma Finder 2.0) s sliding-window dekonvolucí (ReSpect), definice sekvence a modifikací pro validní identifikaci variant.

Hlavní výsledky a diskuse

U referenčního NIST mAb bylo rozlišeno 17 variant odlišných glykoforem a počtu C-terminálních lyzin s dynamickým rozsahem přes tři řády. Mezi nejhojnější patřily G0F/G1F, G1F/G1F a G1F/G2F v kombinaci s 0–2 lyziny. Mimořádná citlivost Orbitrapu umožnila detekovat i velmi nízkou hojnost (~0,19 %). U site-specifického ADC analogu se identifikovaly tři linie zátěže (occasions DAR 2) a navíc formy s jedním či dvěma hexosovými addukty. Rychlost separace eliminovala potřebu předběžného čištění vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Extremně krátké doby analýzy (<3 min) umožňují vysokou propustnost na screeningových etapách vývoje, QC i výrobě.
• Online desalting a nízká spotřeba vzorku (0,2 ng) šetří cenný materiál.
• Vysoká rozlišovací schopnost CE redukuje složitost MS signálu.
• Precizní kvantifikace variant s vysokou hmotnostní přesností a stabilitou měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší uplatnění CE-MS integrovaných platforem v bioprodukci pro monitoring kvality intact proteinů. Další rozvoj se zaměří na automatizaci, vyšší propustnost paralelních analyzátorů a rozšíření detekce na další třídy biologik jako jsou fúzní proteiny či oligonukleotidy.

Závěr

Integrovaný ZipChip CE a Orbitrap MS workflow nabízí efektivní, citlivou a robustní metodu pro rychlý screening intact mAb a ADC heterogenity. Díky kombinaci vysokého rozlišení separace a analýzy ve vysoké hmotnostní oblasti lze během několika minut detekovat i slabě zastoupené varianty, což zvyšuje kvalitu kontroly a urychluje vývoj bioterapeutik.

Použitá instrumentace

• ZipChip HR chip (908 Devices)
• Q Exactive Plus BioPharma MS v HMR režimu (Thermo Fisher Scientific)
• BioPharma Finder 2.0 software (Thermo Fisher Scientific)

Reference

1. Bouchard H. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2014, 24(23), 5357–5363.
2. Huang R.Y.C., Chen G. Drug Discov. Today, 2016, 21(5), 850–855.
3. Kaltashov I.A. et al. Biotechnol. Adv., 2012, 30(1), 210–222.
4. Zhang H., Cui W., Gross M.L. FEBS Lett., 2014, 588(2), 308–317.
5. Dominguez-Vega E. et al. Methods Mol. Biol., 2016, 1466, 25–41.
6. Han M. et al. J. Chromatogr. B, 2016, 1011, 24–32.
7. Sun L. et al. Anal. Chem., 2013, 85(12), 5989–5995.
8. Redman E.A. et al. Anal. Chem., 2016, 88(4), 2220–2226.