Compliant Monitoring of Monoclonal Antibody Titer and Primary Structure Attributes Using a 2D-LC/MS System with UNIFI Informatics

Význam tématu

Ve výrobě a výzkumu monoklonálních protilátek je klíčová rychlá a spolehlivá analýza jak titru, tak primární struktury včetně glykozylace. Dvoudimenzionální kapalinová chromatografie (2D-LC) spojená s vysoce rozlišujícím hmotnostním spektrometrem (MS) nabízí integrované řešení pro kvantitativní i strukturální charakterizaci bez nutnosti složitého offline zpracování.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje automatizované a regulacemi vyhovující měření titru a ověření primární struktury mAb na jednom přístrojovém systému. Kombinací Protein A afinity v první dimenzi a reverzní fáze (RPLC) s hmotnostní spektrometrií v druhé dimenzi bylo cílem ukázat snadnou konfiguraci 1D a 2D režimu v softwaru UNIFI a získat data pro kvantifikaci i glykoformální profil.

Použitá metodika

Vzorek trastuzumabu byl rekonstituován v 0,1 % kyselině mravenčí a rozředěn v diluční řadě pro 1D kvantifikaci. První dimenze probíhala na afinitní kolóně Protein A s UV detekcí při 280 nm pro vytvoření kalibrační křivky. Pro 2D analýzu byla vybrána krátká „heart-cut“ frakce a po at-column diluci převedena na reverzní fázi RPLC pro separaci a in-line MS detekci. Pevná časová okna a isokratický „wash“ krok odstranily nekompatibilní složky před druhou dimenzí.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class Plus s 2D LC technologií (QSM, BSM)
• Kolóna POROS Protein A 20 µm, 2,1×30 mm
• Kolóna XBridge Protein BEH C4, 4,6×50 mm, 300 Å
• Vion IMS QTof hmotnostní spektrometr
• UNIFI Scientific Information System v1.9.4

Hlavní výsledky a diskuse

1D afinitní analýza prokázala lineární vztah mezi koncentrací trastuzumabu (0,05–4 mg/mL) a UV signálem (R2 > 0,999). Vybraný heart-cut o šířce 0,1 min umožnil přenos frakce bez ztráty rozlišení. Druhá dimenze generovala dekonvoluovaný spektrální profil s identifikací hlavních glykoform (G0F/G0F, G1F/G1F, G2F/G2F apod.), což umožňuje potvrdit molekulovou hmotnost a posoudit heterogenitu vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace offline přípravy a rizika kontaminace
• Možnost rychlého přepínání mezi 1D a 2D módem bez fyzických změn zapojení
• Regulacemi vyhovující datový management v UNIFI
• Využití pro screening klonů, procesní monitoring a řízení kvality

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření o víceřezové heart-cut aplikace, implementace komplexních 2D režimů (comprehensive 2D-LC), online monitorování ve výrobních linkách a aplikace pro nové biologické formy (bispecifické protilátky, fusion proteiny). Pokročilá automatizace a integrace datových platforem dále zrychlí rozhodovací procesy ve vývoji i výrobě.

Závěr

Prezentovaná 2D-LC/MS metoda spojuje vysokoprovozní kvantifikaci titru s detailní strukturální analýzou mAb na jediné platformě. Flexibilita konfigurace a automatizace v UNIFI umožňuje robustní a regulatorně vyhovující workflow pro moderní biopharmaceutickou analytiku.

Reference

1. Prentice KM, Wallace A, Eakin CM. Inline Protein A Mass Spectrometry for Characterization of Monoclonal Antibodies. Anal Chem. 2015;87:2023–2028.
2. Williams A, Read EK, Agarabi CD, Lute S, Brorson KA. Automated 2D-HPLC Method for Characterization of Protein Aggregation with In-Line Fraction Collection Device. J Chromatogr B. 2017;1046:122–130.
3. Sandra K, Steenbeke M, Vandenheede I, Vanhoenacker G, Sandra P. The Versatility of Heart-Cutting and Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography in Monoclonal Antibody Clone Selection. J Chromatogr A. 2017;1523:283–292.