Automated Analytical Cation-Exchange Chromatography Fraction Collection and Structural Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants

Význam tématu

Analýza a charakterizace nabitostních variant monoklonálních protilátek je klíčová pro zajištění jejich kvality, bezpečnosti a účinnosti během vývoje a výroby bioterapeutik.
Ion-exchange chromatografie (IEX) umožňuje izolaci jednotlivých nabitostních forem v ne-denaturujících podmínkách, čímž zachovává biologickou aktivitu a umožňuje následnou strukturní i funkční analýzu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat automatizovanou separaci a odběr frakcí nabitostních variant mAb za použití BioResolve SCX mAb kolony spojené s Waters Fraction Manager-Analytical (WFM-A) a jejich následnou charakterizaci kombinovanými LC-MS metodami.
Záměrem bylo optimalizovat naložení, ověřit čistotu frakcí, prokázat možnost re-separace a identifikovat rozdíly v C-terminálních lyzinových variantách, glykosylaci a deamidaci.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Waters Fraction Manager-Analytical (WFM-A)
• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• BioResolve SCX mAb Columns
• Xevo G2-XS QToF Mass Spectrometer
• Empower 3 Software
• MassLynx v4.1
• UNIFI v1.9

Metody:

• CEX separace trastuzumabu a infliximabu na BioResolve SCX mAb kolone s gradientem NaCl
• Automatický odběr nízkovoližních píků (20–40 µl) pomocí WFM-A
• Optimalizace naložení: studie vlivu hmotnostní zátěže a délky kolony (50 vs. 100 mm)
• Intakt masová analýza pomocí RP mAb Polyphenyl kolony a QToF
• Subunit analýza IdeS digescí s/bez redukce DTT
• Peptidová mapovací analýza po trypsinu a Lys-C na BEH300 C18 kolone

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace naložení ukázala, že kolona 4,6×100 mm dovoluje 2,5× vyšší hmotnost než 50 mm bez ztráty rozlišení při prodlouženém gradientu.
WFM-A umožnil přesný odběr úzkých UPLC píků a prokázal možnou re-separaci alternujících frakcí při nízké solnosti.
Intakt MS potvrdil odlišné formy C-terminálních lyzinových variant (0K, 1K, 2K) a rozmanitost N-glykánů (sialylace, fukóza).
Subunit analýza ověřila počty lyzinů na scFc fragmentech a detekovala dílčí redukční stupně disulfidických vazeb.
Peptidová mapa ukázala, že kyselý frakční pik trastuzumabu obsahuje zvýšeně deamidovaný peptid ASQDVNTAVAWYQQKPGK, identifikovaný XIC a MS/MS-fragmentací.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný odběr píků IEX separací šetří čas a minimalizuje ztráty při vzorkování biomolekul.
Možnost kombinace intact, subunit a peptidové analýzy poskytuje detailní obraz modifikací mAb, který je kritický pro kontrolu kvality (CQA) v bioprodukci.
Re-separace alternujících frakcí zvyšuje účinnost purifikace a dovoluje paralelní zpracování více vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace automatizovaných fraction collectorů s dalšími on-line technikami (SPR, bioassaye) pro rychlé hodnocení vazebné a funkční aktivity.
Rozvoj multidimenzionálních LC-MS protokolů umožní souběžné monitorování dalších modifikací (oxidace, glykanová heterogenita).
Nasazení umělé inteligence pro automatické rozpoznávání a kvantifikaci nabitostních variant v reálném čase.

Závěr

Prezentovaná aplikace dokládá, že spojení BioResolve SCX mAb kolony s WFM-A a pokročilou LC-MS analýzou je robustní cestou k detailní charakterizaci nabitostních variant mAb.
Studie demonstrovala optimalizaci naložení, efektivní odběr variant, pokročilou strukturální identifikaci a možnost paralelního zpracování frakcí.

Reference

1. Khawli, L. A.; et al. Charge Variants in IgG1. mAbs. 2010, 2(6), 613–624.
2. Jablonski, J. M.; et al. Small Scale Peptide and Impurity Isolation Using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager-Analytical Systems. Waters Application Note 720005500EN (2015).
3. Lauber, M. A.; et al. Designing a new particle technology for robust charge variant analysis of mAbs. Waters Application Note 720006475EN (2019).
4. Jung, S. K.; et al. Physicochemical characterization of Remsima. mAbs. 2014, 6(5), 1163–1177.
5. Sakae, Y.; et al. Conformational effects of N-glycan core fucosylation of immunoglobulin G Fc region on its interaction with Fcγ receptor IIIa. Sci. Rep. 2017, 7, 13780.