Monitoring of 20 Amino Acids and Other Key Compounds in Fermentation Processes

Význam tématu

Analýza aminokyselin v biotechnologických procesech je klíčová pro optimalizaci růstu mikroorganismů a produkci cílových látek.
Aminokyseliny ovlivňují biologické dráhy, výkonnost buněk a kvalitu konečného produktu.
Intervalní sledování jejich koncentrace umožňuje přesné řízení doplňování živin ve fed-batch a perfuzních kulturách.

Cíle a přehled studie

Vyvinout a validovat metodu LC/MS/MS pro kvantifikaci 20 podivatelných aminokyselin bez nutnosti derivatizace.
Porovnat jednoduchost přípravy vzorků a dobu analýzy s konvenčními RP-HPLC a GC/MS postupy.
Uplatnit metodu pro sledování dynamiky aminokyselin v bioreaktorových kulturách.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kultur byly odstředěny, filtrovány 0,2 µm filtrem a ředěny 0,1 N HCl a acetonitrilem.
Chromatografická separace probíhala na Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolonu (2,1×150 mm, 2,7 µm) při 30 °C, průtok 0,6 mL/min, gradient z 100 % akrylonitrilu na vodně-formátový pufr pH 3.
Detekce na Agilent 6490 Triple Quadruple LC/MS s AJS ESI pozitivním módem, vícečetným reakcím monitorováním (MRM), optimalizovanými fragmentačními a kolizními energiemi.

Hlavní výsledky a diskuse

Linearita pro většinu aminokyselin R² > 0,99 a citlivost LOD v řádu nM–µM.
Přesnost a opakovatelnost intraraktní i mezi-runové do ±20 %.
Rozlišení izobarů leucin/izoleucin a threonin/homoserin umožnilo přesnou kvantifikaci bez chromatografických komplikací.
Při sledování E. coli auxotrofní na Met a Thr se prokázalo rozdílné tempo spotřeby a neočekávané hromadění alaninu a homoserinu.

Přínosy a praktické využití metody

Minimalizace přípravných kroků a rychlý průběh analýzy (~18 min) výrazně zkracují dobu odezvy laboratoře.
Možnost sledovat metabolické odlivy uhlíku a optimalizovat strategii doplňování živin ve skutečných bioreaktorech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace sledování volných nukleotidů, vitaminů a malých organických kyselin s využitím segmentované metody MRM.
Možnost aplikace v průmyslové fermentaci a metabolomických studiích buněčných linií a kvasinek.
Vývoj pokročilých datových analýz pro automatizované monitorování a řízené dávkování substrátů.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda pro 20 aminokyselin nabízí vynikající citlivost, linearitu a reprodukovatelnost bez derivatizace.
Umožňuje detailní sledování průběhu fermentací a metabolitů v reálném čase s minimálním zásahovým časem.

Reference

1. Walther T.; Calvayrac F.; Malbert Y.; Alkim C.; Dressaire C.; Cordier H.; Francois J. M. Construction of a synthetic pathway for the production of 2,4-dihydroxybutyric acid from homoserine. Metab. Eng. 2018, 45, 237–245.