Determination of Amino Acids in Cell Cultures and Fermentation Broths

Význam tématu

Analýza aminokyselin v buněčných kulturách a fermentačních médiích je klíčová pro optimalizaci bioprodukčního procesu a kvalitu bioterapeutik.
Komplexní složení živných agens obsahuje buď nedetekovatelné chromofory, nebo vysoké koncentrace sacharidů, které komplikují klasické UV-metody.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat metodu AAA-Direct kombinující vysokovýkonnou aniontovou chromatografii (AEC) na kolóně AminoPac PA10
a integrovanou pulzní amperometrii (IPAD) pro přímou simultánní detekci všech běžných aminokyselin, sacharidů a alditolů v médiích.
Studie porovnala různé počáteční koncentrace NaOH, ověřila linearitu, přesnost, přesnost opakování i reálné vzorky YPD, LB, MEM
a hybridomové médium.

Použitá instrumentace

• Dionex BioLC system: GP50 gradientní pumpa s degasem, 2 mm mikrobor kolóna
• ED50 elektrochemický detektor v pH módu s referencí Ag/AgCl
• Pracovní elektrody AAA-Direct Certified Disposable Au
• AS50 autosampler s termostatovaným podavačem
• Chromeleon Chromatography Workstation

Použitá metodika

Eluenty: voda, 250 mM NaOH a 1 M vakuově sušený octan sodný pod inertní atmosférou.
Gradienty AAA-Direct uváděné jako „x/y“, kde x je počáteční [NaOH] v mM a y izokratická doba v min.
Optimální rozlišení aminokyselin a glukózy bylo dosaženo při 20–60 mM NaOH a izokratických fázích 2–8 min.
Vzorky: 100–1000× ředěné supernatanty YPD, LB, MEM, hybridomového media analýza přímou injekcí 10–25 µL.
Kolóna AminoPac PA10 separuje 50+ analytů na jedné chromatogramu během 50 min.

Hlavní výsledky a diskuse

Úprava počáteční [NaOH] zásadně mění retenci raně eluujících aminokyselin versus sacharidů (např. oddělení Ala/Thr od glukózy při 40–50 mM).
Lineární rozsah detekce aminokyselin dosahuje 25–750 µM (peak area), pro glukózu 250–500 µM.
Přesnost retence <0,7 % RSD, přesnost plochy 1–8 % RSD při 5denním kontinuálním provozu.
Jednorázové zlaté pracovní elektrody AAA-Direct zvyšují reprodukovatelnost odpovědi mezi elektrodami na 2–9 % RSD,
odpověď na aminokyseliny je o 5–15 % vyšší než u konvenčních elektrod.
V reálných médiích: YPD (20 g/L glukóza, 1000× ředění) stanoví 23 aminokyselin a sacharidů,
LB (10× ředění) rozliší 29 aminokyselin + 49 ostatních sloučenin, MEM (100×) a hybridoma médium (100×) potvrdily stanovení 22 aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní detekce aminokyselin a sacharidů bez derivatizace
• Vysoká citlivost (detekční limity v nM–µM oblasti) a široký lineární rozsah
• Vysoká reprodukovatelnost (<10 % RSD) pro rutinní QA/QC
• Jednoduchá příprava vzorků (přímá injekce ředěných supernatantů)
• Snadná výměna vyčerpané elektrody díky jednorázovému Au formátu

Budoucí trendy a možnosti využití

Sektor bioprocesních analytik směřuje k on-line a on-stream monitorování fermentačních procesů;
další miniaturizace a multiplexace na mikrofluidních platformách; automatizace pre-kolónové přípravy vzorků;
rozšíření metod o biogenní aminy, peptidy, glykosylované produkty;
komplexní chemometrické vyhodnocení pro pokročilou kontrolu kvality a optimalizaci produkce.

Závěr

Metoda AAA-Direct spojuje AEC na kolóně AminoPac PA10 a IPAD pro přímé, citlivé a vysoce reprodukovatelné stanovení aminokyselin a sacharidů
v komplexních médiích. Volba počátečního gradientu NaOH umožňuje optimalizovat separaci v závislosti na vzorku. Jednorázové zlaté elektrody zajišťují konzistentní elektrochemický signál a snižují náklady na údržbu.

Reference

1. Clarke AP, Jandik P, Rocklin RD, Liu Y, Avdalovic N. Anal Chem. 1999;71:2774–2781.
2. Robinett RSR, Herber WK. J Chromatogr. 1994;671:315–322.
3. Hanko VP, Rohrer JS. J Chromatogr. 1994;676:287–295.
4. Herber WK, Robinett RSR. J Chromatogr. 1994;676:287–295.
5. Dionex Corp. Application Note 150. Determination of Amino Acids in Cell Cultures and Fermentation Broths.
6. Jandik P, Cheng J, Jensen D, Manz S, Avdalovic N. J Chromatogr B. 2001;758:189–196.
7. Dionex Corp. Application Note 122. Carbohydrate Analysis in Fermentation Broths.
8. Dionex Corp. Application Note 54. Determination of Sulfite by IEC-PAD.
9. Dionex Corp. Application Note 142. Determination of Tryptophan.
10. Hanko VP, Rohrer JS. Anal Biochem. 2000;283:192–199.
11. Marko-Varga G, et al. J Chromatogr. 1994;665:317–332.
12. Larson TM, et al. Biotech Bioeng. 2002;77:553–563.
13. Myoken Y, et al. In Vitro. 1989;25:477–480.
14. Ham RG. Proc Natl Acad Sci USA. 1965;53:288–293.
15. Dionex Corp. Technical Note 50. AAA-Direct Peptide Analysis.
16. Dionex Corp. Installation Guide AAA-Direct System. Document No. 031481.
17. Dionex Corp. Dionex BioLC System Manual.
18. Dionex Corp. Chromeleon Software Reference Guide.