Underivatized Amino Acid Profiling in Yeast Fermentation Samples

Význam tématu

Analýza složení odpadních médií během fermentace poskytuje klíčové informace o využití živin, uvolňování metabolitů a změnách metabolické aktivity kultury v čase. Kvantifikace volných (neodvozených) aminokyselin přináší přímé poznatky pro optimalizaci procesu, kontrolu kvality a pochopení biochemických trajektorií mikroorganismů bez komplikací zavedených chemickou derivatizací.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem aplikace bylo demonstrovat workflow pro kvantitativní stanovení underivatizovaných aminokyselin přímo ve fermentačních vzorcích Saccharomyces cerevisiae a současně umožnit netargetované profilování metabolitů v jednom LC/TOF běhu. Metoda kombinuje HILIC separaci na biokompatibilním Altura Poroshell 120 HILIC-Z sloupci s vysoce přesnou detekcí Agilent 6230C TOF LC/MS a datovou analýzou v MassHunter prostředí.

Použitá metodika

Vzorky: S. cerevisiae kultivovaná v 20× naředěném YPD médiu; odběry každé 2 hodiny do 12 h a dále 24 h. Po odsíření buněk centrifugace (5 000 × rcf, 5 min), supernatant 1:4 v 50:50 methanol:voda, opět centrifugace (10 000 × rcf, 10 min) a následné 20× ředění do 70:20:10 acetonitril:voda:methanol před injekcí.

Chromatografie: HILIC gradient s mobilní fází A = 10 mM ammoniumacetát pH 9 ve vodě, B = 10 mM ammoniumacetát pH 9 v 90:10 acetonitril:voda; průtok 0,25 mL/min, teplota 30 °C, injekční objem 3 µL, celkový běh 25 min. Metoda zajišťuje retenci a rozlišení většiny aminokyselin v rámci prvních ~10 minut gradientu.

Kvantifikace: Externí kalibrační křivky (n = 4) v rozsahu 50–50 000 nM (v závislosti na sloučenině), s využitím standardu aminokyselin doplněného o glutamin, asparagin a tryptofan. Pro zpracování dat a anotaci byl vytvořen vlastní PCDL obsahující přesné hmotnosti a experimentální retenční časy.

Detekce/akvizice: Agilent 6230C TOF LC/MS v negativní ionizačním módu, m/z rozsah 60–1 000, vysoká hmotnostní přesnost (< 2 ppm) a plnoskenová akvizice pro podporu netargetovaného vyhledávání a pozdější retrospektivní analýzy.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II/III bio LC (železo‑volný, biokompatibilní flow path)
• Agilent Altura Poroshell 120 HILIC‑Z, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm (Ultra Inert)
• Agilent 6230C TOF LC/MS s Jet Stream ion source a VacShield technologií
• Softwarová platforma: Agilent MassHunter Quantitative Analysis 12.1 a MassHunter Explorer 2.0
• Vybrané provozní MS parametry: m/z 60–1 000; sheath gas 300 °C/12 L/min; gas temp 200 °C/10 L/min; nebulizer 40 psi; capillary 3 000 V; polarity negative

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie HILIC‑Z umožnila účinné oddělení underivatizovaných aminokyselin v komplexním fermentačním médiu, včetně baseline separace izomerů leucinu a isoleucinu. Kalibrace pro většinu aminokyselin vykazovaly velmi dobrou linearitu (R2 > 0,998) přes široký dynamický rozsah a opakovatelnost (RSD < 10%). Hmotnostní přesnost byla lepší než 2 ppm, což podporuje vysokou jistotu anotací.

Analýza časových řad ukázala různé kinetiky využití aminokyselin: některé byly rychle vyčerpány během časné fáze fermentace (podpora růstu a syntézy proteinů), jiné se měnily jen nepatrně. Díky plnoskenové TOF akvizici bylo možné současně monitorovat organické kyseliny (např. nárůst kyseliny mléčné do ~8 h) a hexózy, jejichž pokles ilustruje spotřebu cukrů během 24 h.

Netargetovaná extrakce rysů a multivariační analýza (PCA v MassHunter Explorer) ukázaly jasné časové seskupení vzorků, což dokládá celkové posuny metabolického profilu během fermentace a podporuje použití metody i pro objevné studie.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace derivatizace zjednodušuje přípravu vzorků, snižuje chyby spojené s vysoko‑prací derivatizace a chrání integritu citlivých metabolitů.
• Biokompatibilní (železo‑volný) flow path a Ultra Inert sloupec minimalizují interakce kov‑analyte, čímž zlepšují tvar píku a citlivost pro kov‑citlivé sloučeniny.
• Plnoskenová TOF akvizice umožňuje současné cílené kvantifikace i netargetované objevy v jednom běhu a umožňuje retrospektivní analýzu.
• Široký dynamický rozsah kalibrací (řádově 50–50 000 nM) umožňuje zachytit změny hladin jak stopových, tak vysokokoncentrovaných aminokyselin v průběhu fermentace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace workflow do on‑line nebo near‑line monitoringu fermentačních procesů pro rychlý feedback a řízení živin.
• Rozšíření PCDL knihoven a zahrnutí standardů pro širší spektrum metabolitů umožní přesnější anotace a automatizované zpracování.
• Vyšší propustnost a zkrácení běhu (fine‑tuning gradientu a automace přípravy vzorků) pro průmyslové nasazení v procesním vývoji a QC.
• Komplementární použití s jinými módy ionizace, stabilní izotopové označení nebo integrace s proteomikou/metabolomikou pro hlubší biologické závěry.

Závěr

Popsaný HILIC‑LC/TOF workflow umožňuje citlivé, reprodukovatelné a univerzální stanovení underivatizovaných aminokyselin a souběžné netargetované profilování metabolitů v komplexních fermentačních matricích. Kombinace biokompatibilního průtoku, inertního HILIC sloupce a vysokopřesného TOF detektoru dovoluje minimalizovat ztráty a zkreslení způsobené interakcemi s kovovými plochami a poskytuje cenná data pro vývoj a sledování fermentačních procesů.

Reference

1. Maicas S. The Role of Yeasts in Fermentation Processes. Microorganisms. 2020;8(8):1142.
2. Hsiao J.; Chu T.-W.; Kennedy A.; Bivens A.; Blackwell A. Analysis of Underivatized Amino Acids by LC/MS for Bioreactor Cell Culture Monitoring. Agilent Technologies application note 5991-8816EN. 2018.
3. Hsiao J.; Masigol M.; Closser R.; Serge L.; Hu L.-C.; von‑Doehren N.; Tripodi A. A. P.; Blackwell A. Pushing the Boundaries of Chromatographic Separation with Inert HPLC Column Hardware. Agilent Technologies white paper 5994-8618EN. 2025.