Quantitative Analysis of Underivatized Amino Acids in Plant Matrix by Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) with LC/MS Detection

Význam tématu

Aminokyseliny jsou klíčovými komponentami buněčných procesů a jejich přesné stanovení v rastlinných matricích je nezbytné pro oblast potravinářského testování, metabolomiky, zemědělské chemie i environmentálních studií. Kvantitativní analýza za použití LC/MS bez derivatizace urychluje přípravu vzorků a eliminuje potenciální interferující reakce, přičemž zachovává vysokou citlivost a selektivitu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této práce bylo rozvinout a validovat metodu pro současné stanovení širokého spektra podivělaných aminokyselin v extraktu z rostlinných tkání s vysokou citlivostí, linearitou a reprodukovatelností. Metoda využívá chromatografii pomocí hydrofilní interakční fáze (HILIC) a detekci na triple kvadrupóru LC/MS, optimalizovanou pro extrakty z okurkových listů.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity binary pump (G1312B)
• Agilent 1260 Infinity autosampler (G7129A)
• Agilent 1260 Infinity thermostatted column compartment (G1316A)
• Ultralow dispersion kit pro Agilent 1290 Infinity LC Series (5067-5189)
• Agilent 6470 triple quadrupole LC/MS s ESI Jet Stream zdrojem
• Software Agilent MassHunter

Použitá metodika

Vzorky okurkových listů byly rychle zmraženy v kapalném dusíku, homogenizovány a extrahovány 0,5 M HCl. Po centrifugaci se supernatant smíchal s izotopově značenými interními standardy a naředil se 20% vodou v acetonitrilu. Chromatografie probíhala na Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1×100 mm, 2,7 μm) s mobilními fázemi: A – 20 mM formiátu amonného ve vodě (pH 3), B – 20 mM formiátu amonného v 9:1 acetonitril/voda. Gradient od 100 % B k 70 % B během 11,5 min a návrat na výchozí podmínky do 15 min zajišťoval rychlou analýzu. MS detekce v pozitivním režimu ESI byla řízena parametry teploty, plynů a napětí, optimalizovanými pro jednotlivé složky.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla baseline separace 23 aminokyselin v běhu 15 minut, včetně obtížně rozlišitelných isobarů leucinu/izoleucinu a threoninu/homoserinu. Linearita sedmibodových kalibračních křivek v rozsahu 50–10 000 ng/mL byla vynikající (R2 > 0,995), signál/šum při 50 ng/mL převyšoval 100:1 pro většinu aminokyselin a reprodukovatelnost retenční doby i odpovědi (RSD < 3 %) prokázala vysokou stabilitu metody. Testy recovery v matrici okurkových listů ukázaly průměrné zotavení mezi 90–115 % pro většinu analyzovaných látek.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená procedura umožňuje rychlou a citlivou kvantifikaci aminokyselin v komplexních rostlinných extraktech bez nutnosti chemické derivatizace, což urychluje analýzu a minimalizuje riziko chyb. Metodu lze využít v rutinní QA/QC laboratoři, v potravinářské a zemědělské chemii, při studiích metabolomických profilů i environmentálních monitoringech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat rozšíření na další vysoce polární metabolity, integraci vysokoprůtokových autosamplerů pro vyšší vzorkovací kapacitu a spojení s nativními tokovými systémy pro metabolická toková měření. Dále je perspektivní aplikace v on-line chromatografických systémech a AI-řízené optimalizaci metodiky.

Závěr

Metoda HILIC-LC/MS pro podivělané aminokyseliny na Agilent 6470 Triple Quad poskytuje rychlou, robustní a vysoce citlivou analýzu v rostlinných matricích. Vynikající rozlišení, linearita i reprodukovatelnost potvrzují její vhodnost pro široké spektrum analytických aplikací.

Reference

• Kennedy A., Bivens A. Methods for the Analysis of Underivatized Amino Acids by LC/MS. Agilent Technologies Application Note, 5991-8582EN, 2017.